基于局部（表面）两亲性的聚D-脯氨酸及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸及其制备方法与应用，采用溶液缩聚方法合成制备聚D-脯氨酸的均聚多肽。该聚合物具备一定程度的IRI活性和TH效应，且生物相容性好、用量低，在作为冷冻低温保护剂方面有一定应用前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物蛋白
，更加具体地说，涉及一种具有局部(表面)两亲性聚合物及其制备方法，其单体和聚合物分别可视为一种最小的抗冻肽和抗冻蛋白模拟物。

技术介绍

[0002]随着组织工程、蛋白质工程和基因疗法等新兴的可再生医学技术的快速发展，对如何保存细胞、组织和器官提出了新的、更高的要求。目前常用的低温保存方法主要是依靠添加大量的小分子冷冻保存剂，如DMSO、PVA和甘油等，然而研究已经证实，上述物质对细胞、组织等均存在一定毒副作用，如DMSO的长期低温保存会使DNA发生一定程度的甲基化，影响细胞等传代过程，而甘油也存在用量过大(>30wt％)且后续去除步骤复杂繁琐等缺点。开发新的无毒副作用、生物相容性好且用量低的抗冻物质具有很大的现实意义。
[0003]人们在北极等寒冷地区鱼类中发现了一种能在低温下保护生命体免受冻伤的抗冻(糖)蛋白(AF(G)Ps)，它能够调节冰的形成和生长，可以在含量极低的状况下，为生命体提供优异的抗冻耐低温性能。近年来研究发现，AF(G)Ps主要有三种效应：1.动态冰塑造(DIS)效应，即AF(G)Ps会促使冰晶的生长为针刺状，已经证明，这对细胞等保存是不利的；2.热滞(TH)效应，即冰点的非平衡降低，导致冰点低于熔点，即冰点与熔点之间存在一个差值；3.冰再结晶抑制(IRI)效应，即对冰再结晶的动力学过程抑制，从而抑制冰晶的生长。虽然AF(G)Ps具备优异的抗冰防冻作用，但是由于其潜在的免疫原性及毒性作用和DIS效应，使其应用受到很大限制。根据AF(G)Ps的结构和空间构象，研究开发具有可调和定制功能的合成模拟物具有广泛的应用前景。
[0004]近年来，人们不断加大AF(G)Ps模拟物的研究，已经开发出多种具有低毒副、用量低且抗冻保存效果较好的模拟肽。如Ben及其同事报道了一种C端连接半乳糖基丝氨酸和甘氨酸的糖肽具有高效的IRI活性且所需浓度很低(Liu,Suhuai,et al."In vitro studies of antifreeze glycoprotein(AFGP)and a C-linked AFGP analogue."Biomacromolecules 8.5(2007):1456-1462.)；Gibson及其同事报道的表面两亲性甘油聚合物，具备分离的亲水和疏水域，具有较好的IRI活性(Graham,Ben,et al."Facially amphipathic glycopolymers inhibit ice recrystallization."Journal of the American Chemical Society 140.17(2018):5682-5685.)。
[0005]目前文献中关于合成AF(G)Ps模拟物的方法多种多样，包括ATRP、RAFT、ROMP、自由基聚合等方法。关于分子结构设计的出发点主要涉及到模拟物表面两亲结构域、含氧官能团(羟基和环氧基)等方面。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有生物相容性，基于局部(表面)两亲性的P(D-Pro)
n
的制备方法和应用。本专利技术采用溶液缩聚方法合成制备聚D-脯氨酸(P(D-Pro)
n
)的均聚多肽。该聚合物具备一定程度的IRI活性和TH效应，且生物相容性好、用
量低，在作为冷冻低温保护剂方面有一定应用前景。
[0007]本专利技术的技术目的通过下述技术方案予以实现。
[0008]基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸及其制备方法，按照下述步骤进行：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、D-脯氨酸和2-肟氰乙酸乙酯均匀分散在有机溶剂中，在惰性保护气体氛围下进行反应，反应温度为室温。
[0009]在本专利技术的技术方案中，以EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和2-肟氰乙酸乙酯为反应催化剂，活化D-脯氨酸(D-Pro)分子上的羰基，使之与另一D-脯氨酸分子的仲胺基团反应，生成-CO-NH-，从而发生D-脯氨酸的自缩聚反应，生成聚D-脯氨酸。
[0010]而且，有机溶剂为二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或者四氢呋喃。
[0011]而且，室温为20—25摄氏度，反应时间为5—20小时，优选10—18小时。
[0012]而且，在反应结束之后得到深黄色溶液，进行真空干燥，再将产物均匀分散在超纯水中，用盐酸调节pH小于7(如3—4)，加入甲醇溶解固体；进行透析并定期换水；最后将产物进行冻干，得到灰白色粉末，即为聚D-脯氨酸(P(D-Pro)
n
)。
[0013]而且，惰性保护气体为氮气、氦气或者氩气。
[0014]而且，在进行反应时，首先将EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)均匀分散在有机溶剂中，室温惰性保护气体氛围下搅拌，之后冷却至0℃；再将D-脯氨酸(D-Pro)和2-肟氰乙酸乙酯混合后加入到上述有机溶剂中，溶液瞬间变为黄色。
[0015]而且，调整1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯和D-脯氨酸三者之间用量，以合成了具有不同分子量的聚合物。
[0016]而且，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯、D-脯氨酸的摩尔比为1：1：(0.5—2)，优选1：1：(1—1.5)。
[0017]本专利技术中采用溶液缩聚反应，反应方法成熟，步骤简单，过程可控，并且未使用EDC/NHS组合，加入了2-肟氰乙酸乙酯，降低反应过程中存在的副反应，使聚合物结构均一、可控。生成的P(D-Pro)
n
具有PPⅡ型的空间构象，该构像已知与IRI活性有关。生物相容性良好，细胞毒性低且用量少，可以用于低温保存细胞、组织等，是一种新的冷冻保存剂，初步解决了目前冷冻保存剂用量多且生物相容性差的缺点。
[0018]与现有技术相比，本专利技术首先利用溶液缩聚反应，反应技术成熟稳定，过程简单，反应条件易满足。合成的聚合物P(D-Pro)
n
首先分子量和分散性可控，质谱表征显示数均分子量范围为1300-3000；其次还拥有较大的热滞(TH)效应，表明有一定的防冻能力，应用到冷冻低温保存技术中；其次具有长时间下良好生物相容性的特点；最后其局部(表面)两亲性结构，为聚合物拥有IRI活性提供了结构基础。综上，P(D-Pro)
n
具有的多方面优势，使其成为一种生物相容性良好，毒副低且用量少的冷冻保护添加剂成为可能。
附图说明
[0019]图1为聚D-脯氨酸(P(D-Pro)
15
)的核磁谱图。
[0020]图2为聚D-脯氨酸(P(D-Pro)
15
)的质谱图。
[0021]图3为聚D-脯氨酸(P(D-Pro)
15
)的DSC测试曲线图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸，其特征在于，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和2-肟氰乙酸乙酯为反应催化剂，活化D-脯氨酸分子上的羰基，使之与另一D-脯氨酸分子的仲胺基团反应，生成-CO-NH-，从而发生D-脯氨酸的自缩聚反应，生成聚D-脯氨酸，数均分子量范围为1300-3000。2.根据权利要求1所述的基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸，其特征在于，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯、D-脯氨酸的摩尔比为1：1：(0.5—2)。3.根据权利要求1所述的基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸，其特征在于，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯、D-脯氨酸的摩尔比为1：1：(1—1.5)。4.基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、D-脯氨酸和2-肟氰乙酸乙酯均匀分散在有机溶剂中，在惰性保护气体氛围下进行反应，反应温度为室温。5.根据权利要求4所述的基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：任丽霞，高淑强，袁晓燕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：