一种纳米花复合膜的纳米酶H2O2传感器的制备方法及其应用技术

活细胞释放的H2O2被认为是疾病诊断和身体状况测量的指标之一，与人体许多疾病密切相关。本发明专利技术研制了一种新型纳米酶传感器，用于检测活细胞样品中H2O2的浓度。本实验采用高比表面积MOF(ZIF

【技术实现步骤摘要】
一种纳米花复合膜的纳米酶H2O2传感器的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物传感器
，尤其涉及一种电化学方法检测H2O2的纳米酶生物传感器、及其构建方法和应用，用于血浆样本中H2O2含量的检测。

技术介绍

[0002]人体中的活性氧(ROS)被认为是生成老化物质，损伤遗传因子，造成衰老的元凶之一，其中过氧化氢(H2O2)是其中重要一员，血浆中的H2O2被认为是疾病诊断和衡量身体状况的指标之一，人们对快速、准确检测H2O2有极大需求，电化学检测技术因为灵敏度高，检测限低，方便快捷等优点被认为是检测H2O2的理想方法。
[0003]过氧化氢(H2O2)是一种代表性的活性氧簇(ROS)物质，在生物体内主要来自于细胞呼吸、蛋白质折叠或是各种新陈代谢的终产物，作为动植物体内一系列生理生化反应的调控物质，尽管它们在各种生物和病理事件中作为介质发挥重要作用，但过量和不受控制H2O2会引起氧化应激反应，导致器官和组织功能衰退，氧化应激反应在癌症和心血管疾病中均扮演着重要的角色，外部环境中过量的的H2O2具有很强的化学活性，因此它同样是氧化应激相关疾病的常见标记物，这是由于活性氧核之外存在不成对的电子，会破坏生物的代谢并导致生物的氧化损伤，同时，H2O2具有强氧化性，常被用作高效的消毒杀菌剂，广泛用于食品卫生，纺织，环保，化工等领域，环境残留中的H2O2与人体的接触将加速细胞衰老危害人体健康，因此准确、快速、灵敏地检测H2O2非常重要，目前，H2O2的检测方法主要包括高效液相色谱法，碘化钾法，比色法等，但是，这些方法具对检测人员技能要求高，仪器分析成本高以及现场检测困难等缺点。因此，开发痕量方法对于人体和环境中H2O2的检测尤为重要，电化学传感器的灵敏，简单和快速的特点已引起研究人员的广泛关注。
[0004]无机纳米材料作为模拟酶，克服了传统生物酶易失活，环境要求苛刻与成本高等缺点，贵金属纳米材料具有稳定性好，催化性强，可重复使用等独特的电子结构特征和物理化学性能，其表面具有大量的活性位点与生物酶功能类似的性质受到广泛关注，其中贵金属纳米材料(Au、Pt等)，金属卟啉及其衍生物通常被认为类似许多酶的催化活性中心，例如辣根过氧化物酶(HRP)。

技术实现思路

[0005]为了克服传统生物酶易失活，环境要求苛刻与成本高等缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种具有重复性好、灵敏度高和稳定性强的H2O2纳米酶生物传感器。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供上述纳米酶生物传感器的制备方法，利用MOF(ZIF
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67)材料的多孔高比表面积与Au@Pt纳米花的催化活性，组装构建获得性能稳定的用于超灵敏和快速检测H2O2的纳米酶传感器。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供上述纳米酶传感器在作为人体血浆中的活性氧之一的H2O2定量检测中的应用。
[0008]本专利技术的上述目的通过以下技术方法实现：
[0009]第一方面，本专利技术的检测血浆中的纳米酶传感器，由参比电极、对电极及修饰电极组成，所述修饰电极通过工作电极表面构建金属有机骨架(MOF)
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Au@Pt纳米花复合膜得到；
[0010]其中：所述金属有机骨架(MOF)
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Au@Pt纳米花材料，ZIF
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Au@Pt材料是通过一锅合成超声辅助方法制备的。首先，称量硝酸钴(Co(NO3)2·
6H2O，2.91克)和2
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甲基咪唑(C4H6N2，3.28克)，然后将它们溶解在250毫升无水甲醇中。在超声作用下(频率45kHz，功率300W)将C4H6N2溶液缓慢倒入Co(NO3)2·
6H2O溶液中，然后在25℃继续超声反应1h。然后加入2mLH2PtCl6(3mM)和3mLHAuCl4(3mM)混合溶液，搅拌并反应3小时。最后，将其用无水甲醇洗涤3次并离心，并将产物在80℃下真空干燥，以获得约0.6g的ZIF
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Au@Pt纳米花复合物。
[0011]所述金属有机骨架(MOF)
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Au@Pt纳米花复合膜传感器的制备主要通过滴涂法构建，传感器构建前，先将GCE电极使用氧化铝粉末在抛光布上抛光出镜面，并用超纯水洗涤，最后用氮气吹干，在室温下制备GCE/MOF
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Au@Pt纳米花复合膜。
[0012]优选的，将3μL制备的复合膜溶液滴涂在玻碳电极表面，形成均匀平整的膜，然后滴加5μLBSA(1％)溶液封闭并干燥，所得到的传感器在不用时储存在4℃环境下，该传感器将MOF
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Au@Pt纳米花复合膜作为模拟酶催化氧化H2O2产生电流变化，达到定性定量检测H2O2的目的。
[0013]优选的，所述工作电极为铂电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极。
[0014]优选的，应用于检测底液的铁氰化钾溶液为由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液。
[0015]优选的，所述H2O2纳米酶传感器的线性检测范围为0.8～3mM。
[0016]优选的，所述H2O2纳米酶传感器的检出限为0.005μM。
[0017]优选的，活细胞样本制备方法为：向75cm2培养瓶中加入细胞培养基，并均匀分散原始264.7细胞，将上述细胞置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中，当细胞生长到90％汇合时，离心并用PBS缓冲液洗涤，用血细胞仪计数，将收集的细胞分布在30mLN2饱和的PBS溶液(pH＝7.4)中以供使用，并用
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0.12V电压实时检测细胞中产生的H2O2，刺激剂诱导细胞产生H2O2，将其添加到无细胞PBS中，并且还使用安培检测。
[0018]第二方面，所述纳米酶传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0019](1)对工作电极进行表面预处理。
[0020](2)将金属有机骨架结合Au@Pt纳米花的溶液滴加到步骤(1)表面预处理后的工作电极表面，室温晾干。
[0021](3)将牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，室温晾干，得修饰电极。
[0022](4)将步骤(3)所得修饰电极与所述参比电极和所述对电极组成三电极体系，即得所构建的电化学检测H2O2物纳米酶传感器。
[0023]其中，所述金属有机骨架结合Au@Pt纳米花溶液和牛血清白蛋白溶液的滴加量体积比为1:1:1。
[0024]优选的，步骤(1)中，所述工作电极表面预处理的步骤为：将工作电极依次使用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，然后置于铁氰化钾溶液中进行活化处理，取出，用超纯水冲洗，氮气吹干。
[0025]第三方面，上述生物传感器在人体血浆中H2O2定量检测中的应用，线性检测范围为0.8～3mM，检出限为86nM。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米花复合膜的纳米酶H2O2传感器的制备方法，其特征在于，包括以下有效步骤：a、在本方法中，ZIF
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Au@Pt材料是通过一锅合成超声辅助方法制备的，首先，称量硝酸钴(Co(NO3)2·
6H2O，2.91克)和2
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甲基咪唑(C4H6N2，3.28克)，然后将它们溶解在250毫升无水甲醇中。在超声作用下(频率45kHz，功率300W)将C4H6N2溶液缓慢倒入Co(NO3)2·
6H2O溶液中，然后在25℃继续超声反应1h；然后加入2mLH2PtCl6(3mM)和3mLHAuCl4(3mM)混合溶液，搅拌并反应3小时；最后，将其用无水甲醇洗涤3次并离心，并将产物在80℃下真空干燥，以获得约0.6g的ZIF
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Au@Pt纳米花复合物；b、金属有机骨架(MOF)
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Au@Pt纳米花复合膜传感器的制备：通过滴涂法构建，传感器构建前，先将GCE电极使用氧化铝粉末在抛光布上抛光出镜面，并用超纯水洗涤，最后用氮气吹干，在室温下制备GCE/MOF
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Au@Pt纳米花复合膜；c、将3μL制备的复合膜溶液滴涂在玻碳电极表面，形成均匀平整的膜，然后滴加5μLBSA(1％)溶液封闭并干燥，将所得到玻碳电极应用于检测血液中H2O2的传感器中，即得到的纳米花复...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文祥，
申请(专利权)人：陈文祥，
类型：发明
国别省市：