一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法，在分析DA分布中，将新鲜天然红藻组织进行固定，利用新急速冻结置换法制成切片，再加入DA抗体进行免疫组织化学染色，在显微镜下观察样品中的DA位置情况；在分析DA含量中，将处理后的混合物放入离心机，转速设定为3500rpm，离心16m i n，结束后取上清液。再进行一次重复试验，再次提取红藻中的软骨藻酸。把在之前的操作中提取出的上清液合并，用纯水定容到20mL后，然后用0.45um滤膜进行超过滤，所制成的试验液进行LC/MS检测，对所得数据进行分析统计处理。此方法最大限度的保留红藻内的DA及细胞内部结构，降低在处理过程中DA的流出量，可以更清晰的对其进行观察，所取得的效果更优于目前的其他方法。果更优于目前的其他方法。果更优于目前的其他方法。

【技术实现步骤摘要】
一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法


[0001]本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法。

技术介绍

[0002]软骨藻酸作为海洋毒素的一类也是天然产物,人们在预防它的毒性同时,应充分利用其生物活性。软骨藻酸作为一种神经毒素，递质和阻断剂，在水产领域中对贝类直接产生危害，间接的影响着人类的生命健康，但同时研究实验也表明软骨藻酸对昆虫也有杀灭能力，其对蟑螂苍蝇的杀死效果不亚于r
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BHC等，这些说明了DA在某些方面有一定的应用价值如作为驱虫剂的应用，或作为神经生理学研究的有用对象。当前，国内外很多研究者正继续深入地探讨DA相关特性和机制，以达到控制危害作用和利用相关生化特性的目的。
[0003]DA常用的检测方法主要有生物分析法、高效液相色谱法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法等等。生物分析法灵敏度较低，选择性弱，因此应用有限。高效液相色谱法是目前官方指定的标准方法，该方法检测限低，灵敏度高，特异性强，应用广泛。高效液相色谱的检测器有紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，由于贝类提取液中干扰组分复杂，光度检测往往不能提供化合物的充分结构信息，因此会引起假阳性的结果，而质谱能提供化学物质的结构信息(LC/MS)，是一种高效的方法，能作为DA确证的分析方法。另外，在传统检测方法的基础上，近年来发展了许多新的检测方法，如神经受体结合检测技术、生物传感器法等，但目前应用范围不广，还存在一些缺陷，没有被广泛采用。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法。
[0005]根据本申请实施例提供的技术方案，一种分析红藻细胞内的DA分布方法，
[0006]包括以下步骤：
[0007]T1.将新鲜天然红藻组织进行固定，再用0.1％高酸缓冲液将固定好的红藻组织洗净，将洗净的红藻组织装入器皿中并加入冻结防止剂乙二醇，同时,添加液态氮冷却的异戊烷迅速将红藻组织冻结,然后将冻结后的红藻组织在丙酮内浸泡，并每间隔一段时间就将红藻组织取出在温度为
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80℃、
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20℃、4℃及室温的丙酮环境中进行轮流置换，形成红藻样品，
[0008]T2.在不同温度环境中处理后的所述红藻样品用丙酮、苯甲酸甲酯、硬化剂和树脂进行涂抹处理，使其聚合了一晚上，制成包埋试料，
[0009]T3.将包埋试料用膜片安装在刀刃上，将切片机的距离设置为5um的条件切薄，将其放置在滚动玻璃上，重复多次薄切树脂切片，得到优质切片，
[0010]T4.切片首先放在蒸馏水中浸泡15分钟，然后依次用流水和蒸馏水清洗，清洗后的切片要在0.5％的黄臭剂中浸泡5秒钟，再次用流水和蒸馏水清洗后，分别经过乙醇、丁醇和
氧苯进行脱水和透视，得到样品；
[0011]T5.用显微镜对所述样品进行观察并记录好放大倍率拍摄图片。
[0012]一种分析红藻细胞内DA含量的方法，
[0013]包括以下步骤：
[0014]S1.称取2g步骤T1中制好的红藻样品，充分细剪后加入8mL纯水，混匀涡旋后放进沸腾的热水浴中加热5min，期间混匀2次，加热后放入冰水中冷却至室温，全程保证水溶液量不变。再将混合物放入远心分离仪，在3500r/min下离心16min，结束后用微细管收集上层清液，得到上清液a和原液a，
[0015]S2.将原a重复步骤S1的操作，得到上清液b，将上清液a和上清液b进行合并，合并后的上清液以纯水定容至20mL，再使用0.45μm滤膜进行超过滤，得到试验液；
[0016]S3.用液相质谱联用仪LC/MS法对步骤2中得到的试验液进行分析，得到红藻细胞内的DA含量。
[0017]综上所述，本申请的有益效果：
[0018]一、最大限度的保留红藻内的DA，降低在处理过程中DA的流出量；
[0019]二、在免疫组织化学染色中分析红藻细胞内DA的分布时，可以更清晰的对其进行观察，所取得的效果更优于目前的其他方法。
附图说明
[0020]通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0021]图1为一般方法即HE染色法的组织切片图；
[0022]图2为本专利技术处理后观察到的组织切片图；
[0023]图3为藻体内DA的细微分布图；
[0024]图4为藻体内DA量的测定结果图；
[0025]图5为藻体内DA量的测定结果图。
[0026]图中标号：
具体实施方式
[0027]下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关专利技术，而非对该专利技术的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与专利技术相关的部分。
[0028]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
[0029]一种分析红藻细胞内的DA分布方法，
[0030]一、选样
[0031]分别选择新鲜天然株的枝部分和根部分。
[0032]二、固定
[0033]要想让分离出组织和细胞保持正常的生理状态，就要让它在取出之后立刻死亡，防止出现病理变化影响最后的观察结果。固定不仅可以达到这种目的，还可以让细胞中的
可溶性物质转变为不溶性物质，防止它们溶化和消失。固定的另一作用是固定剂会让组织发生一定的硬化，而有利于之后的处理，让这些细胞和组织易于染色。
[0034]固定剂的选择会影响到之后的各项操作，对最终的观察结果会造成直接影响，因此固定剂的选择很重要。良好的固定剂都会具有一些共同的特点，例如，可以很快地渗透到植物组织中去，将细胞中那些易溶解的物质转变成不溶物，从而让组织在之后的操作中维持原有的形状，可以提高细胞内含物的折光度、媒染、染色等能力，在一定程度上具有保存剂的作用。
[0035]三、快速冷冻
[0036]用0.1M酪酸缓冲液洗净固定好的红藻组织。在容器内缓慢加入冻结防止剂乙二醇时,添加了用液态氮冷却的异戊烷迅速冻结后,然后取出红藻组织，使其在
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80℃,
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20℃,4℃及室温的丙酮内置换，每次置换期间的时间间隔为5
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10分钟左右。用丙酮、苯甲酸甲酯和树脂进行了中间剂处理，并在加入硬化剂的树脂上涂满在样本上，使其聚合了一晚上。
[0037]四、薄切
[0038]将包埋试料用膜片安装在刀刃上，将切片机的距离设置为5um的条件切薄，将其放置在滚动玻璃上。重复多次薄切树脂切片，最后选择效果最佳的切片进行下一步染色实验。
[0039]五、染色观察
[0040]切片首先放在苏木素溶液中浸泡15分钟，然后依次用流水和蒸馏水冲洗，洗净后的切片要在0.5％曙红液染色中浸泡5秒钟，再本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分析红藻细胞内的DA分布方法，其特征是，包括以下步骤：T1.将新鲜天然红藻组织投入预先配好的固定液中，再用0.1M酪酸缓冲液将固定好的红藻组织洗净，洗净后装入器皿中并缓慢加入冻结防止剂乙二醇，同时,添加用液态氮冷却的异戊烷迅速将红藻组织冻结,然后将冻结后的红藻组织在丙酮内浸泡，并分别在温度为
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80℃、
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20℃、4℃及室温的丙酮环境中将红藻组织轮流置换，形成红藻样品，T2.在不同温度环境中处理后的所述红藻样品用丙酮、苯甲酸甲酯、硬化剂和树脂进行涂抹处理，使其聚合了一晚上，制成包埋试料，T3.将包埋试料用膜片安装在刀刃上(C35)，将切片机的距离设置为5um的条件切薄，将其放置在滚动玻璃上，重复多次薄切树脂切片，得到优质切片，T4.HE染色：切片首先放在苏木素溶液中浸泡15分钟，然后依次用流水和蒸馏水冲洗，洗净后的切片要在0.5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜珊珊，
申请(专利权)人：潍坊科技学院，
类型：发明
国别省市：