一株谷氨酸棒杆菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一株谷氨酸棒杆菌株及其应用。本发明专利技术筛选到可利用甘露糖的菌株且表现出比较优异的菌体生物量的谷氨酸棒杆菌株，可应用于生产甘露糖。进一步，对所述菌株进行基因改造获得能够高效生产GDP

【技术实现步骤摘要】
一株谷氨酸棒杆菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一株谷氨酸棒杆菌株及其应用。

技术介绍

[0002]谷氨酸棒杆菌是一种兼性厌氧、生长快速的革兰氏阳性菌，1957年，这种微生物首次从自然界中分离得到。由于其过量合成谷氨酸的能力被命名为谷氨酸棒杆菌。目前谷氨酸棒杆菌已被认为GRAS安全菌株，而且该菌株生理特性研究较为清晰，遗传操作和外源基因表达体系已建立，经过代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌重组菌株已经广泛应用于氨基酸、核苷酸、生物塑料以及其它精细化学品的工业化生产，目前氨基酸产能，约2/3是以谷氨酸棒杆菌为底盘细胞进行发酵生产获取的，在生物制造产业中扮演重要角色。
[0003]D
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甘露糖是一种己醛醣，唯一用于在临床上的糖质营养素，具有多种生理功能，促进胰岛素分泌，诱导抗炎细胞因子表达，预防尿路感染，促进肠道益生菌生长。甘露糖广泛存在于魔芋、酵母细胞壁等多种生物质资源中，同时也是半纤维素中一种主要的六碳糖单元，含量仅次于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。截至目前，研究人员已开发高效利用木糖和阿拉伯糖的工业菌株，但是针对甘露糖代谢利用报道较少，因此，甘露糖高效代谢，促进半纤维素转化利用，将对提升半纤维素甚至天然木质纤维素的附加值具有重要意义。
[0004]甘露糖可被酵母菌株代谢利用，但是可发酵利用甘露糖的细菌报道较少，有研究通过提高细胞内甘露糖6
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磷酸异构酶活性，有助于提升谷氨酸棒杆菌代谢甘露糖能力，然而该菌株代谢利用甘露糖依然需要较高的菌体浓度，且甘露糖代谢速率较低。GDP
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甘露糖和GDP
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岩藻糖是生物体内合成甘露基聚糖和岩藻基聚糖的关键前体，其高效制备对于制备甘露寡糖和岩藻糖基乳糖的合成至关重要。甘露糖代谢非常有助于提升胞内GDP
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甘露糖和GDP
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岩藻糖的含量，因此迫切开发可高效代谢利用甘露糖的细菌菌株，合成更多种类的化学品。

技术实现思路

[0005]本专利技术人通过筛选到可利用甘露糖的菌株且表现出比较优异的菌体生物量的谷氨酸棒杆菌株进而完成本专利技术。
[0006]本专利技术目的一是提供一株谷氨酸棒杆菌株，命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）Cgl
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M19 CGMCC No.22679菌株已于2021年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.22679。
[0007]本专利技术目的二是谷氨酸棒杆菌株Cgl
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M19在甘露糖代谢方面应用。其特征表现为，谷氨酸棒杆菌Cgl
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M19可在富含甘露糖的培养基中进行生长代谢。
[0008]所述培养基不仅仅包括丰富培养基如LB培养基，脑心浸粉，玉米浆，玉米粉等，还包括基本盐培养基如M9基本盐培养基，CGXII基本盐培养基等。
[0009]所述富含甘露糖的培养基，不仅仅包含添加甘露糖的培养基，还应包括甘露聚糖
水解后获得甘露糖的培养基。
[0010]所述培养基中甘露糖浓度为0.1 g/L
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200 g/L，培养温度为25
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35℃。
[0011]本专利技术目的三是提供一株谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
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GM，其特征表现为，以谷氨酸棒杆菌Cgl
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M19为出发菌株，通过引入甘露糖6
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磷酸变位酶基因（ManB）和甘露糖1
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磷酸糖基转移酶基因（ManC），获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
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GM。具体构建方法为：（1）构建重组载体pEC
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ManB
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ManC根据谷氨酸棒杆菌来源的甘露糖6
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磷酸变位酶（ManB）(SEQ ID NO.1)和甘露糖1
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磷酸糖基转移酶（ManC）的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）设计引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，PCR扩增获得manB和manC基因，通过限制性酶切连接方法，连接至重组表达载体pEC
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XK99E中，得到重组质粒pEC
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ManB
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ManC。
[0012]（2）通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
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M19中导入重组载体pEC
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ManB
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ManC，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株Cgl
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GM。
[0013]本专利技术目的四是提供谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
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GM在GDP
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甘露糖合成中的应用，其特征表现为，谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
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GM可发酵葡萄糖、甘露糖获得GDP
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甘露糖，其中谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
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GM发酵甘露糖时GDP
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甘露糖含量高于葡萄糖。
[0014]所述发酵条件为，甘露糖或葡萄糖浓度为5
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50 g/L, 所述培养温度为25
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35℃。
[0015]本专利技术目的五是提供一株谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
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GF，其特征表现为，以谷氨酸棒杆菌Cgl
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M19为出发菌株，通过引入甘露糖6
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磷酸变位酶基因（ManB）和甘露糖1
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磷酸糖基转移酶基因（ManC），GDP
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甘露糖4,6
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脱水酶基因（Gmd）和GDP
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岩藻糖合成酶基因（WcaG）,获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl
‑
GF。具体构建方法为：（1）构建重组载体pEC
‑
ManB
‑
ManC根据谷氨酸棒杆菌来源的甘露糖6
‑
磷酸变位酶（ManB）和甘露糖1
‑
磷酸糖基转移酶（ManC）的核苷酸序列设计引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，PCR扩增获得manB和manC基因，通过限制性酶切连接方法，连接至重组表达载体pEC
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XK99E中，得到重组质粒pEC
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ManB
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ManC。
[0016]（2）构建重组载体pXMJ19
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Gmd
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WcaG根据大肠杆菌来源的GDP
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甘露糖4,6
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脱水酶（Gmd）（SEQ ID NO.3）和GDP
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岩藻糖合成酶（WcaG）（SEQ ID NO.4）的核苷酸序列设计引物，以大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增获得gmd和wcaG基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pXMJ19中，得到重组质粒pXMJ19
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株谷氨酸棒杆菌株（Corynebacterium glutamicum），其特征在于，已于2021年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22679。2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌株在甘露糖代谢方面的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，培养所述谷氨酸棒杆菌株的培养基中添加甘露糖。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基中甘露糖浓度为0.1 g/L
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200 g/L，且培养的温度为25
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35℃。5.一株谷氨酸棒杆菌重组菌株，其特征在于，以如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌株为出发菌株，引入甘露糖6
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磷酸变位酶基因和甘露糖1
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磷酸糖基转移酶基因而获得。6.如权利要求5所述的谷氨酸棒杆菌重组菌株在GDP
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甘露糖合成中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，以葡萄糖，或甘露糖为原料发酵获得GDP
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨建刚，田朝玉，张同，孙媛霞，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：