一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用。所述外泌体疫苗是使M1型巨噬细胞摄取特定的肿瘤抗原Ag，然后提取携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞的外泌体，即得到外泌体疫苗M1

【技术实现步骤摘要】
一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤免疫治疗药物
，具体地说是一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肿瘤免疫治疗具有突出的优势和良好的治疗效果。但在肿瘤的发展过程中，逐渐形成了免疫抑制的肿瘤微环境。TME主要由血管、免疫细胞、成纤维细胞、细胞外基质以及细胞因子生长因子等可溶性因子组成。肿瘤细胞的免疫原性差、效应T细胞功能的抑制和肿瘤微环境浸润的大量免疫抑制细胞这三大主要因素造成了TME的免疫抑制，这一现象严重制约了免疫治疗的效果。巨噬细胞是免疫抑制细胞的主要组成部分，也是免疫抑制的一个重要影响因素。TAM分为两种功能截然不同的表型。M1型巨噬细胞促进抗原呈递和Th1激活，分泌促炎细胞因子和免疫激活因子，以促进抗肿瘤功能。而M2型巨噬细胞通过分泌免疫抑制性细胞因子以及趋化因子，选择性募集T细胞来抑制抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤的侵袭、生长和转移。受肿瘤微环境的影响TAM大多表现为M2型的功能，所以将TAM极化为M1型可以十分有效的逆转肿瘤的免疫抑制，大大提高T细胞激活效率，显著增强肿瘤免疫治疗效果。
[0003]巨噬细胞可塑性高，可通过多种方式极化为M1型。在体外，常采用LPS或IFN
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γ实现对巨噬细胞的有效极化。在体内则往往利用纳米体系通过多种多样的方式来实现TAM的极化。首先，IL
‑
12作为典型的M1型巨噬细胞分泌的促炎细胞因子，具有极化巨噬细胞为M1型的能力，但由于单独给药IL
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12不稳定并带来全身副作用，Wang等人设计并合成了微环境相应的纳米颗粒作为细胞因子递送系统将IL
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12递送到TME释放并极化TAM来实现肿瘤治疗中微环境的免疫调节；而Cheng等人更是将编码IL
‑
12基因的质粒DNA递送至TME实现巨噬细胞的极化。此外，一些无机纳米粒子如Fe3O4也能有效极化巨噬细胞为M1型，这可能与这些材料在肿瘤微环境发生芬顿反应或类芬顿反应产生ROS有关。而以R848为代表的TLR7和TLR8的双受体激动剂对巨噬细胞的极化也有很大的影响，Weissleder等人通过β环糊精负载R848在多种小鼠肿瘤模型中证明了肿瘤免疫微环境中巨噬细胞向M1表型改变。
[0004]从机制上来看，一些信号通路的激活或抑制会对巨噬细胞的表型产生影响。例如在对近期临床上显示出抗肿瘤作用的抗疟药氯喹进行研究时发现，氯喹是通过激活NF
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κB信号通路使TAM极化为M1型巨噬细胞从而显示出抗肿瘤的活力。Chen等人和Zhang等人分别通过MnO2纳米粒子的构建以及Ndrg2基因的敲除来激活NF
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κB信号通路，也同样实现了巨噬细胞向M1型的极化。而CSF1R、MAPK和STAT3信号通路的抑制才会使巨噬细胞向M1型极化。除此以外，micRNA也会对巨噬细胞的表型产生影响。突变型p53癌症可以通过外泌体中miR
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1246将巨噬细胞重编程为支持肿瘤的状态。miR155可用于上调TAM中IL
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12、iNOS以及MHC II的表达，以及miR
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125b将巨噬细胞重新极化为免疫激活表型来增强紫杉醇的抗肿瘤效果。此外，Kim等人在对巨噬细胞囊泡的研究中也提到miR
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155、miR
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125和miR
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21可将巨噬细胞极化为M1表型，而miR
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34a、let
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7c以及let
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7f则可以将巨噬细胞极化为M2表型。
[0005]TAM在体内的极化常常借助纳米载体来完成，而外源性的材料作为载体通常会存
在免疫原性高、有潜在的毒副作用等缺点。因此，急需研制一种毒副作用小、效果好的疫苗，将肿瘤相关巨噬细胞极化为M1型，从而使巨噬细胞由免疫抑制促进肿瘤侵袭转移的状态转变为免疫支持抗肿瘤的状态。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就是提供一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用，以解决在免疫抑制的肿瘤微环境下仅使用常规免疫治疗手段不能有效激活免疫应答，且现有改变肿瘤微环境的药物存在免疫原性高、有潜在的毒副作用等的问题。
[0007]本专利技术的目的是这样实现的：一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗，所述外泌体疫苗是使M1型巨噬细胞摄取特定的肿瘤抗原Ag，然后提取携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞的外泌体，即得到外泌体疫苗M1
Ag
‑
Exos。
[0008]所述M1型巨噬细胞是利用脂多糖或IFN
‑
γ将原代巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞。
[0009]所述原代巨噬细胞为人或小鼠来源的巨噬细胞。
[0010]所述特定的肿瘤抗原Ag为OVA抗原、黑色素瘤相关抗原 MAGE以及通过细胞或组织破碎提取出的黑色素瘤特异性抗原中的至少一种。
[0011]上述的外泌体疫苗的制备方法，包括以下步骤：（a）携带抗原的M1型巨噬细胞的培养：用50
‑
200ng/mL的脂多糖对培养的原代巨噬细胞孵育12
‑
24 h，使原代巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞；然后用0.05
‑
0.15mg/mL的肿瘤抗原Ag与M1型巨噬细胞共孵育24
‑
48 h，得到携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞；（b）提取外泌体疫苗：将携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞培养2
‑
5天后，收集细胞培养上清液，然后利用超滤离心管进行浓缩除杂，将离心上清液过滤后再次进行离心处理，去除上清液后重悬，即得到外泌体疫苗M1
Ag
‑
Exos。
[0012]步骤（b）中，细胞培养上清液的处理步骤为：先利用 100 KD 超滤离心管在 4500 g 转速、4
°
C条件下离心，将浓缩后的细胞上清液在2000 g转速、4
°
C条件下离心20
‑
40 min，收集上清液并在10000 g转速、4
°
C条件下再次离心40
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50min；取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，收集过滤液，将过滤液移至新的离心管中，然后在100000 g 转速、4
°
C条件下离心60
‑
80min，去除上清液，用预冷的PBS重悬后，再次在100000 g 转速、4
°
C条件下离心60
‑
80min，去除上清液，用预冷的PBS重悬，得到外泌体疫苗M1
Ag
‑
Exos。
[0013]上述的M1型巨噬细胞外泌体疫苗在针对肿瘤微环境的免疫调节药物中的应用。
[0014]本专利技术构建了可调节肿瘤免疫微环境的外泌体疫苗增强免疫治疗效率，利用M1型巨噬细胞外泌体为载体实现了肿瘤相关巨噬细胞的极化以及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗，其特征是，所述外泌体疫苗是使M1型巨噬细胞摄取特定的肿瘤抗原Ag，然后提取携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞的外泌体，即得到外泌体疫苗M1
Ag
‑
Exos。2.根据权利要求1所述的外泌体疫苗，其特征是，所述M1型巨噬细胞是利用脂多糖或IFN
‑
γ将原代巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞。3.根据权利要求2所述的外泌体疫苗，其特征是，所述原代巨噬细胞为人或小鼠来源的巨噬细胞。4.根据权利要求1所述的外泌体疫苗，其特征是，所述特定的肿瘤抗原Ag为OVA抗原、黑色素瘤相关抗原 MAGE以及通过细胞或组织破碎提取出的黑色素瘤特异性抗原中的至少一种。5.权利要求1所述的外泌体疫苗的制备方法，其特征是，包括以下步骤：（a）携带抗原的M1型巨噬细胞的培养：用50
‑
200ng/mL的脂多糖对培养的原代巨噬细胞孵育12
‑
24 h，使原代巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞；然后用0.05
‑
0.15mg/mL的肿瘤抗原Ag与M1型巨噬细胞共孵育24
‑
48 h，得到携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞；（b）提取外泌体疫苗：将携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞培养2
‑
5天后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振华，刘会芳，吕芳芳，张金超，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：