一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料及组织工程领域。本发明专利技术包括：将甲壳素改性制备成羟丙基甲壳素，然后复合胶原蛋白和透明质酸钠，构建了可注射温敏复合型水凝胶，加载新西兰兔的脂肪间充质干细胞和京尼平，最后在生理温度下原位形成含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶。本发明专利技术制备的水凝胶具有三维多孔结构，有利于营养物质和代谢废物的传递，为细胞的生长提供优良的微环境，既有利于维持脂肪间充质干细胞的存活和生物活性，又能够促进脂肪间充质干细胞分化成软骨组织，同时具有较高的力学强度，因此可广泛用于软骨组织工程领域。广泛用于软骨组织工程领域。广泛用于软骨组织工程领域。

【技术实现步骤摘要】
一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医用材料及组织工程领域，具体涉及一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]关节软骨损伤是较为常见的骨科疾病，其预后差，复发率高，给全世界数千万病人带来生活上的不便和精神上的痛苦。骨折及骨折后治疗不当、严重创伤、感染、骨肿瘤等是造成关节软骨损伤的重要原因。对于早期或者较轻程度的软骨损伤，采用药物处理即可使缺损的组织自行修复。但是当损伤的软骨出现较大程度的缺损时，则需要寻找更为有效的方式才能治疗。尽管自体或异体软骨移植是修复软骨缺损的有效手段，但也存在明显的不足，如造成二次损伤，组织来源有限、供体与受体组织尺寸和形状错配，造成供区损伤或功能障碍等。因此，亟待寻找一种简单、有效的方式治疗软骨缺损。
[0003]以支架材料和脂肪间充质干细胞为基础的组织工程技术为软骨缺损的治疗提供了新途径。近年来，支架材料中可注射温敏水凝胶的应用倍受关注，其优点是通过微创介入的方式将加载脂肪间充质干细胞的水凝胶注射到患处，根据缺损的尺寸和形状进行自我调节，形成特定形状的填料与缺损腔体匹配。另外，可注射温敏水凝胶能在生理温度下原位形成凝胶，避免细胞流失。甲壳素作为一种性能优良的天然高分子材料，其所制备的温敏水凝胶具有作为组织工程支架材料的潜力，但较低的力学强度限制了其应用。为此，中国专利(CN108310460A)利用京尼平交联温敏甲壳素水凝胶，虽然交联后水凝胶的强度明显提高，但交联剂的引入减弱了水凝胶的细胞相容性，从而限制了其在软骨组织工程领域的应用。解决这一问题最简单有效的方式即引入能够促进细胞增殖的生物活性物质，如胶原蛋白和透明质酸。众多研究已证实胶原蛋白和透明质酸可促进细胞增殖和组织再生，且加载脂肪间充质干细胞可进一步提升组织再生效率(Zhang et al.,2019,19:155.；Zhou et al.,2018,71:496
‑
509.；Yang et al.,2017,57:1
‑
25.)。因此，构建含脂肪间充质干细胞的可注射温敏水凝胶，协调水凝胶的力学强度，提高其与细胞的生物相容性并确保软骨组织的再生功能是需要解决的关键问题。

技术实现思路

[0004]针对以上问题，本专利技术提供了一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用，以解决现有技术中干细胞存活率较低且活性较弱的问题。
[0005]为了实现上述第一方面的目的，本专利技术采用以下技术方案：一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述复合型水凝胶材料包含脂肪间充质干细胞、羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠。
[0006]所述胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(0.1％
‑
3％):(0.1％
‑
0.6％)。
[0007]羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(1.2％
‑
4％):(0.1％
‑
3％):(0.1％
‑
0.6％)；脂肪间充质干细胞的含量为1
×
106‑1×
108个/mL。
[0008]本专利技术的可注射温敏复合型水凝胶中，除了上述主要成分为脂肪间充质干细胞、羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠，还可含有多肽、寡肽、氨基酸或具有促细胞生长作用的生物活性物质。
[0009]为了实现上述第一方面的目的，本专利技术采用以下技术方案：一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0010]S1.将甲壳素溶于氢氧化钠和尿素的混合碱溶液中，加入环氧丙烷反应制备羟丙基甲壳素，经透析、干燥、溶解获得羟丙基甲壳素溶液。
[0011]S2.将羟丙基甲壳素溶液与胶原蛋白溶液和透明质酸钠溶液混合制备复合溶液。
[0012]S3.利用S2中制备的复合溶液重悬脂肪间充质干细胞，在搅拌条件下获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合溶液。
[0013]S4.将京尼平加至S3的可注射温敏复合溶液中，然后置于相应的凝胶温度下，获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶。
[0014]本专利技术上述方法通过将羟丙基甲壳素复合胶原蛋白和透明质酸钠制备可注射温敏水凝胶，有利于提高水凝胶中干细胞的活性和存活率。通过加载脂肪间充质干细胞构建含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，生理温度下原位成型实现水凝胶的固化为细胞提供稳定的生长环境，从而提高水凝胶的组织再生能力。通过上述特定制备方法不仅能够提高干细胞的存活率和活性，有利于软骨组织的再生，还能提高水凝胶的力学强度，使水凝胶对细胞的快速增殖和外力作用具有更强的支撑作用。
[0015]优选地，所述步骤S1中甲壳素的分子量范围为0.5
‑
100万，S2中胶原蛋白和透明质酸钠的分子量范围分别为5
‑
30万和8
‑
230万。该优选方案带来的直接技术效果是使复合溶液不至于过粘影响水凝胶的制备过程，也不至于过稀难以形成凝胶，从而更有利于制备工艺的控制和连续化生产的稳定进行。
[0016]优选地，所述步骤S2制备的复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为(15
‑
20):(1
‑
3):(1
‑
3)。
[0017]优选地，所述步骤S3中，可注射温敏复合溶液含有脂肪间充质干细胞的浓度为1
×
106‑1×
108个/mL。
[0018]在所述制备方法中，多肽、寡肽、氨基酸或具有促细胞生长作用的生物活性物质可以在所述步骤S2中随羟丙基甲壳素溶液一起与胶原蛋白溶液和透明质酸钠溶液混合制备复合溶液。
[0019]在所述制备方法中，加入环氧丙烷反应制备羟丙基甲壳素的反应条件为：首先在冰浴状态下，机械搅拌反应0.5
‑
2h，然后升温至4
‑
10℃反应12
‑
36h，再升温至15
‑
34℃反应1
‑
12h，最后冷却至0
‑
10℃静置1
‑
12h，这样既可以防止环氧丙烷在搅拌过程中不断挥发影响反应，还能防止生成的羟丙基甲壳素固化影响反应地顺利进行，从而使整个反应更充分且凝胶的温度敏感特性更好。在本专利技术中，所述凝胶温度为37℃。
[0020]在所述制备方法中，羟丙基甲壳素的干燥方式可以是自然干燥、鼓风干燥、冷冻干燥、真空干燥和临界点干燥。
[0021]在本专利技术的另一个实施例中，所述步骤S4中获得的含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶中京尼平的浓度为0.01
‑
0.05wt％。通过对京尼平的进一步限定，有利于
制备得到不同力学强度的水凝胶。
[0022]所述方法得到的含脂肪间充质干细胞的可注射本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述复合型水凝胶材料包含脂肪间充质干细胞、羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠。2.根据权利要求1所述的一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(0.1％
‑
3％):(0.1％
‑
0.6％)。3.根据权利要求1所述的一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(1.2％
‑
4％):(0.1％
‑
3％):(0.1％
‑
0.6％)；脂肪间充质干细胞的含量为1
×
106‑1×
108个/mL。4.根据权利要求1所述的一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1.将甲壳素溶于氢氧化钠和尿素的混合碱溶液中，加入环氧丙烷反应制备羟丙基甲壳素，经透析、干燥、溶解获得羟丙基甲壳素溶液；S2.将羟丙基甲壳素溶液与胶原蛋白溶液和透明质酸钠溶液混合制备复合溶液；S3.利用S2中制备的复合溶液重悬脂肪间充质干细胞，在搅拌条件下获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合溶液；S4.将京尼平加至S3的可注射温敏复合溶液中，然后置于相应的凝胶温...

【专利技术属性】
技术研发人员：张强，胡梦君，伍飞飞，黄伟，孙伟庆，
申请(专利权)人：杭州协合医疗用品有限公司，
类型：发明
国别省市：