基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法技术

本发明专利技术涉及基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，借助现有的HPLC技术对核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性进行快速检测，采用环核苷酸为反应底物，环核苷酸在环核苷酸磷酸二酯酶的催化后分解为GMP，而GMP会进一步代谢为核苷和碱基，环核苷酸可以通过紫外吸收光(254nm)检测。检测时可以通过反应底物环核苷酸产生的峰面积来判断其残余量，进而计算出核苷酸磷酸二酯酶抑制剂的活性，相较于现有的检测方式，本发明专利技术中的检测方法简便、快捷、成本低。成本低。成本低。

【技术实现步骤摘要】
基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法


[0001]本专利技术涉及生物分析化学
，具体涉及一种HPLC检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法。

技术介绍

[0002]高效液相色谱(HPLC)的工作原理是混合物各组分通过与固定相、流动相之间的相互作用，在色谱柱中进行分离纯化。
[0003]固定相是存在于色谱柱中一种非常小的多孔颗粒材料，流动相是在高压迫使下通过色谱柱的一种溶剂或混合溶剂。用注射器注入样品，通过一个连接样品回路的阀门，使样品与流动相混合，随后样品中各组分以不同的速率通过色谱柱，由于各组分与固定相之间的吸附能力不同，各组分依次流出色谱柱，通过合适的检测器将组分浓度转换成电信号传递到计算机的HPLC软件上。运行结束后，在HPLC软件中就可以得到色谱图。
[0004]环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)是一种水解环鸟苷酸(cGMP)的酶，PDE5A1是其中的一种亚型。
[0005]环核苷酸(cGMP)是机体广泛存在的一种重要活性物质。环核苷酸是人体内重要的第二信使，参与机体多种信号通路。环核苷酸不仅可以调节能量的代谢，而且可以调控神经递质的传递、基因表达、激素调节、免疫反应以及细胞的增殖和分化等，对血管的舒张、神经递质的传递以及肾脏功能均有调控作用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，提出基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，解决决明子提取物区分困难的问题。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤一、将环核苷酸溶解于Tris
‑
HCl缓冲溶液中，得到环核苷酸溶液；
[0009]步骤二、将环核苷酸磷酸二酯酶溶解于Tris
‑
HCl缓冲溶液中，得到环核苷酸磷酸二酯酶溶液，预先于35℃水浴中温育3～10min，与不同浓度的环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂混合均匀，得到混合溶液；
[0010]步骤三、将步骤一中的环核苷酸溶液预先于35℃水浴中温育3～10min，然后将步骤二中的混合溶液加入到环核苷酸溶液中，形成反应体系；
[0011]步骤四、将步骤三中的反应体系于35℃水浴温育，然后于100℃水浴加热，得到最终溶液；
[0012]步骤五、将最终溶液进样到高效液相色谱仪中，检测环核苷酸浓度，借此推算出环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性。
[0013]优选的是，所述Tris
‑
HCl缓冲溶液浓度为40
‑
60mM,pH＝8。
[0014]优选的是，所述环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂为西地那非。
[0015]优选的是，所述反应体系中包含浓度为0.01～0.5μg/mL的环核苷酸磷酸二酯酶溶液，浓度为0～750nM的西地那非溶液，终浓度为0.5～150μg/mL的环核苷酸溶液。
[0016]优选的是，所述步骤五中，高效液相色谱仪使用Kromasil&C18色谱柱，4.6mm
×
250mm，粒度5μm。
[0017]优选的是，所述步骤五中，使用的流动相为90％缓冲溶液，10％甲醇。
[0018]优选的是，所述缓冲溶液为6.8mg/mL的磷酸二氢钾水溶液。
[0019]优选的是，所述高效液相色谱分仪中的流动相流速为1ml/min。
[0020]本专利技术产生的有益效果是：本专利技术中的方法采用环核苷酸为反应底物，环核苷酸在环核苷酸磷酸二酯酶的催化后分解为GMP，而GMP会进一步代谢为核苷和碱基，环核苷酸可以通过紫外吸收光(254nm)检测。
[0021]环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂的加入能够有效的抑制环核苷酸磷酸二酯酶的活性，环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂的含量会引起抑制效率的变化，通过高效液相色谱分析反应底物中环核苷酸峰面积变化即可得出环核苷酸的含量变化并借此推算出抑制剂的抑制效率，简化了传统血清检验方法，具有简便、快捷、低成本的优点。
附图说明
[0022]图1是环核苷酸浓度与峰面积大小的关系曲线图；
[0023]图2是实例1中检测西地那非对环核苷酸磷酸二酯酶的抑制效率曲线图；
[0024]图3是实例2中检测朝藿定A对环核苷酸磷酸二酯酶的抑制效率曲线图；
[0025]图4是实例3中检测朝藿定B对环核苷酸磷酸二酯酶的抑制效率曲线图；
[0026]图5是实例4中检测朝藿定C对环核苷酸磷酸二酯酶的抑制效率曲线图；
[0027]图6是实例5中检测宝藿苷Ⅰ对环核苷酸磷酸二酯酶的抑制效率曲线图；
[0028]图7是实例6中检测淫羊藿苷对环核苷酸磷酸二酯酶的抑制效率曲线图；
[0029]图8是实例7中检测2
”‑
O－鼠李糖基淫羊藿次苷对环核苷酸磷酸二酯酶的抑制效率曲线图。
具体实施方式
[0030]实施例1
[0031]基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，包括以下步骤：
[0032]步骤一、取8支0.5mL离心管，分别加入浓度为7.5μg/mL的环核苷酸溶液，将环核苷酸用浓度为50mMPH＝8的Tris
‑
HCl缓冲溶液(100mM MgCl2)稀释，预先于35℃水浴中温育10min；
[0033]步骤二、将终浓度为0.0625μg/mL的环核苷酸磷酸二酯酶与不同浓度的西地那非溶液混合，得到八组不同的混合溶液，西地那非的终浓度为0、0.183105、0.732422、2.929688、11.71875、46.875、187.5、750nM，反应总体积为60μL；
[0034]步骤三、将步骤一的8支离心管中分别加入步骤二中的混合溶液，形成反应体系；
[0035]步骤四、将步骤三中的反应体系于35℃水浴温育90min，然后于100℃水浴加热
2min，得到最终溶液；
[0036]将最终溶液进样到高效液相色谱仪中，检测环核苷酸，得到最终溶液中环核苷酸的总峰面积；
[0037]液相色谱分析条件为：
[0038]色谱柱：Kromasil&C18色谱柱，4.6mm
×
250mm，粒度5μm；
[0039]柱温：30℃；
[0040]流动相：体积比：缓冲溶液浓度为90％，甲醇浓度为10％，其中，缓冲溶液为浓度为6.8mg/mL的磷酸二氢钾水溶液；
[0041]流速：1mL/min；
[0042]上样量：最终溶液50μL。
[0043]配制不同浓度的环核苷酸溶液，使用高效液相色谱仪绘制其色谱图，记录环核苷酸峰面积，最终得到如图1所示的环核苷酸浓度与峰面积关系曲线。
[0044]将最终溶液中的环核苷酸峰面积与图1进行比对即可换算出不同浓度的西地那非的抑制效率，最终结果如图2。
[0045]实施例2
[0046]基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、将环核苷酸溶解于Tris
‑
HCl缓冲溶液中，得到环核苷酸溶液；步骤二、将环核苷酸磷酸二酯酶溶解于Tris
‑
HCl缓冲溶液中，得到环核苷酸磷酸二酯酶溶液，预先于35℃水浴中温育3～10min，与不同浓度的环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂混合均匀，得到混合溶液；步骤三、将步骤一中的环核苷酸溶液预先于35℃水浴中温育3～10min，然后将步骤二中的混合溶液加入到环核苷酸溶液中，形成反应体系；步骤四、将步骤三中的反应体系于35℃水浴温育，然后于100℃水浴加热，得到最终溶液；步骤五、将最终溶液进样到高效液相色谱仪中，检测环核苷酸浓度，借此推算出环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性。2.根据权利要求1所述基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，其特征在于：所述Tris
‑
HCl缓冲溶液浓度为40
‑
60mM...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐剑，巫岳，石万银，郑向炜，杨跃军，刘源才，
申请(专利权)人：劲牌有限公司，
类型：发明
国别省市：