气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种气体神经保护剂，为氩氧混合气。气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法包括如下步骤：S1、建立缺血性脑卒中的动物和细胞模型；S2、在细胞模型上观察氩气对脂多糖刺激的原代小胶质细胞炎症激活的影响和分子机制；S3、探讨氩气对小胶质细胞活化中NLRP3炎症小体的调控在脑缺血再灌损伤的神经保护中作用。本发明专利技术提供的NLRP3炎症小体抑制剂为气体抑制剂，针对于现有抑制剂的缺点进行改进，不仅给药方式容易，且不依赖于血管再通，能在急性发作期延长治疗时间窗，最重要的是，作为一种气体神经保护剂，氩氧混合气具有更好的治疗效果。气具有更好的治疗效果。气具有更好的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究及其应用。

技术介绍

[0002]炎症小体是固有免疫的重要因素，它作为大型多蛋白复合物可识别宿主来源的危险信号分子(DAMPs)和病原体编码的病原相关分子模式(PAMPs)，且可触发并激活炎症性天光氨酸激酶1(Caspase
‑
1)，介导白细胞介素1β(IL
‑
1β)和白细胞18(IL
‑
18)被释放到胞外，发挥促进炎症发展的作用。目前炎症小体根据受体蛋白的不同分为NLRP1、NLRP2、NLRP3、HIN
‑
200家族的细胞质DNA传感器黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)及NLRC4等，在这些炎症小体中最具特征的是NLRP3炎症小体。
[0003]NLRP3炎症小体是目前研究较多的炎症小体，它的受体蛋白是NOD样受体蛋白3，属于NLRs家族的一员，NLRs家族通常由N端的Caspase募集和活化结构域或热本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种气体神经保护剂，其特征在于，为氩氧混合气，其中，氩气与氧气的浓度分配比为79:21。2.一种气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、建立缺血性脑卒中的动物和细胞模型；S2、在细胞模型上观察氩气对脂多糖刺激的原代小胶质细胞炎症激活的影响和分子机制；S3、探讨氩气对小胶质细胞活化中NLRP3炎症小体的调控在脑缺血再灌损伤的神经保护中作用。3.根据权利要求2所述的气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤为：S1.1、建立缺血性脑卒中动物模型采用的动物模型为缺血再灌注模型，实验分为四个组：假手术组：结扎右侧颈总动脉血流，再灌注时松开结扎部位；脑缺血再灌注组：右侧大脑中动脉栓塞3h后取出线栓；氩气组：在tMCAO术后1h采用氩氧混合气治疗3h；NLRP3炎症小体抑制剂MCC950组：分别在tMCAO组的小鼠缺血1h和3h时进行腹腔注射MCC950；具体手术过程为：将成年雄性ICR小鼠异氟烷麻醉后，仰卧固定在鼠板上，消毒，颈中正线开口，用弯头镊子进行钝性分离，沿胸锁乳突肌内缘三角区分离肌肉筋膜，分离出颈总动脉，颈内动脉，颈外动脉，并电离颈外动脉；颈总动脉近心端结扎，颈内动脉接近颈总分叉处用动脉夹阻断血流，在颈外动脉远端剪开一小口，将头端用硅胶包裹的尼龙线插入；松开动脉夹，将线栓从颈内动脉推入大脑中动脉起始端，结扎固定；手术过程小鼠体温保持37℃，大脑中动脉栓塞一定时间后缓慢拔出尼龙线，电凝颈外动脉并松开颈总动脉，实现再灌注；S1.2、建立细胞炎症反应模型使用C57BL/6红皮鼠进行原代培养小胶质细胞：将C57BL/6红皮鼠断头处理取出脑组织，使用弯镊剥离海马组织，取皮层，37℃胰酶消化12分钟，取出后使用3ml培养基终止消化，并清洗2次；使用1ml枪头将含有培养基的脑组织吹打混匀，离心12000rpm、5min，离心结束后，去上清，加入培养基进行重悬，吹打均匀后种于T75培养瓶中，一星期后加入含有生长因子的培养基，再培养一周可收集原代培养小胶质细胞；将含有原代小胶质细胞的培养瓶置于37℃摇床，将培养瓶中的上清液转移至15ml离心管中，离心12000rpm、5min，使用1ml培养基重悬，进行细胞计数，种于小皿中于37℃培养箱中培养，细胞密度在5x105‑
1x106，在接种后24h之内使用。4.根据权利要求2所述的气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，步骤S2的具体步骤为：S2.1、通过RT
‑
qPCR和Western Blot技术检测原代培养小胶质细胞中NLRP3炎症小体的表达情况；S2.2、进行体外LPS刺激原代培养小胶质细胞炎症反应模型的实验，实验分组为Con组，LPS组和+iAr2+LPS三个组：对照组，对照组细胞不做任何处理，直接置于培养箱中培养3h，结束后加入裂解液进行后续处理；LPS组是在小皿中加入40μl 100ng/ml的LPS刺激3h，刺激期间始终置于37℃培养箱里培养，结束后同样加入裂解液进行后续处理；氩气组是在LPS组的基础上，加入LPS之后立即放入氩气舱进行氩氧混合气治疗3h，氩气舱中使用37℃循环水浴保持舱内温度，氩气治疗结束后加入80μl RIPA裂解液或者300μl TRIZOL裂解液进行后
续处理；采用RT
‑
qRCR和Western Blot技术，检测LPS刺激3h后在小胶质细胞中NLRP3炎症小体的表达情况。5.根据权利要求4所述的气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，步骤S2.1和S2.2中RT
‑
qPCR实验步骤如下：S2.1.1、应用Trizol试剂从原代培养小胶质细胞样品中提取总RNA；S2.1.1.1、吸尽6孔板中原代培养小胶质细胞的培养液，每孔加入500μl Trizol，使其覆盖细胞，再用吸管或加样器吹打3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中；S2.1.1.2、在装有裂解物的离心管中加入100μl的氯仿，振荡器上充分振荡混匀20s，室温放置5min，12000rpm 4℃离心10min，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中；S2.1.1.3、加入二分之一体积Trizol的量的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀5min，12000rpm 4℃离心15min，在管底可见RNA沉淀；弃上清，按每毫升Trizol加入1mL 75％乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀，12000rpm4℃离心2min，弃去液体，小心勿丢弃RNA沉淀，室温倒置晾干5
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10min；S2.1.1.4、溶解：加入适量DEPC处理水使RNA沉淀溶解，
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80℃储存备用；S2.1.2、应用M
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MLV逆转录酶合成第一链cDNA；S2.1.3、在总体积为20μL的SYBR Green PCR Master Mix中进行实时定量PCR，所有反应均一式两份进行，使用2
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法计算NLRP3炎症小体的相对表达量。6.根据权利要求4所述的气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，步骤S2.1和S2.2中Western Blot实验步骤如下：S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，薛珂，张云峰，祁勉，折佟平，何娟，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：