一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用制造技术

本发明专利技术公开一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用，涉及分子生物学技术领域；本发明专利技术公开一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用。

技术介绍

[0002]芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)，为十字花科芸薹属一年生草本植物，是中国的特产蔬菜之一。芥蓝主要以肥嫩的花薹和嫩叶作为食用部分，营养丰富，富含芥子油苷、类胡萝卜素、维生素C等营养成分，具有很高的营养价值和保健作用，深受人民群众的喜爱。
[0003]芥子油苷，又名硫代葡萄糖苷(Glucosinolates，GS)，是一类含氮和硫的植物次生代谢物质，通常情况下可以与钠盐或钾盐的形式存在于细胞质中。芥子油苷是一类仅在十字花科植物中发现的次生代谢物质。芥子油苷及其降解产物具有重要的生物学功能，例如杀菌杀虫作用，化学防御癌症作用。但不同种类的芥子油苷其活性也不尽相同，例如脂肪类芥子油苷萝卜硫苷(Glucoraphanin，GRA)的降解产物萝卜硫素是迄今为止发现的一种抗癌活性最强的天然植物化学物质，而3
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丁烯基芥子油苷(Gluconapin，GNA)的抗癌活性较小，且对蔬菜中的苦味有所贡献。
[0004]芥蓝中芥子油苷含量较为丰富，以3
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丁烯基芥子油苷为主，达到总芥子油苷的50％以上，而具有抗癌活性的萝卜硫苷含量极低，通常不足3
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丁烯基芥子油苷含量的3％。由于芥蓝所有品种都是如此，因此利用常规杂交育种的方式无法获得高含量萝卜硫苷的芥蓝材料。虽然常规杂交育种是一种普遍的获得新品种的育种方式，但这种育种方式周期长，一般需要5
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10年，且盲目性高、工作量巨大，且其结果是无法预期的。而化学诱变的方法同样存在耗时长、盲目性高、工作量大的问题。
[0005]短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9，CRISPR/Cas9)是一种全新的基因组编辑技术，可对DNA进行定点编辑，较常规转基因方法具有明显优势，越来越多的研究人员对其产生了兴趣。如今，CRISPR/Cas9基因编辑技术已成功的应用于多种植物基因编辑研究，如烟草、拟南芥、小麦、水稻、玉米等。在拟南芥和水稻的研究中揭示CRISPR/Cas系统具有较高的特异性，因此利用CRISPR/Cas系统改良作物性状，提高作物的产量、品质、抗逆性、抗病性成为可能。因此，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究一种创制高含量萝卜硫苷的芥蓝材料的方法，能定向的、精准的进行基因编辑，更能将育种时间缩短到1
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2年，既解决了常规杂交育种周期长、盲目性高、工作量大的问题，又解决了利用常规杂交育种无法获得高含量萝卜硫苷的芥蓝材料的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用，以解决上述现有技术存在的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO：1
‑
5的至少一种。
[0008]本专利技术还提供一种CRISPR/Cas9表达载体，所述CRISPR/Cas9表达载体包含所述的靶序列。
[0009]本专利技术还提供一种高含量萝卜硫苷芥蓝的创制方法，所述创制方法为：利用所述的靶序列构建CRISPR/Cas9表达载体后进行遗传转化。
[0010]进一步的，所述靶序列为以下任意一种：
[0011](1)SEQ ID NO：1
‑
5中的任意一种；
[0012](2)SEQ ID NO：1
‑
5的任意相同或不相同的两种串联而成；
[0013](3)SEQ ID NO：1
‑
5的任意相同或不相同的三种串联而成。
[0014]进一步的，所述构建CRISPR/Cas9表达载体的步骤为：
[0015](1)根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo DNA序列，并在其5
’
端分别添加酶切位点，退火复性得到具有粘性末端的DNA双链序列；
[0016](2)采用限制性内切酶Bbs I酶切pSG载体，获得酶切产物；
[0017](3)将步骤(2)所述酶切产物与步骤(1)所述DNA双链序列进行连接后，转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，挑取单菌落进行震荡培养，获得pSG
‑
Target重组质粒；
[0018](4)使用EcoR I
‑
HF和Xba I内切酶，将步骤(3)所述的pSG
‑
Target重组质粒、pCC质粒分别进行双酶切，获得酶切产物；
[0019](5)将步骤(4)所述的酶切产物进行连接，获得pCC
‑
Target
‑
sgRNA载体，转化农杆菌感受态，获得芥蓝Target
‑
CRISPR/Cas9表达载体。
[0020]进一步的，所述遗传转化为农杆菌介导的遗传转化。
[0021]进一步的，所述农杆菌介导的遗传转化的具体步骤为：
[0022](1)将芥蓝种子表面消毒后，接种于M1培养基上生长；
[0023](2)切取无菌苗带柄子叶，接种于M2培养基上生长；
[0024](3)取芥蓝CRISPR/Cas9表达载体，接种于含抗生素的LB或YEB固体培养基上获得单克隆，挑取所述单克隆于含抗生素的YEB或LB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养，以1∶100的比例放大培养，取获得的菌液离心收菌，用等体积的MS液体培养基悬浮后获得农杆菌菌液；
[0025](4)所述农杆菌菌液活化后浸染预培养后的带柄子叶，将侵染后的带柄子叶按顺序置于M3、M4和M5培养基上培养；不定芽长至1
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2cm时在M5培养基中进行继代培养，待不定芽长到3
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4cm时在M6培养基中进行生根培养，即获得农杆菌介导的遗传转化后的植株。
[0026]进一步的，所述继代培养为每隔20天继代一次。
[0027]进一步的，所述M1培养基包括1/2MS培养基、蔗糖20g/L和琼脂粉7.5g/L，pH值为5.8；
[0028]M2培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L和2，4
‑
二氯苯氧乙酸0.5mg/L，pH值为5.8；
[0029]M3培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6
‑
苄氨基嘌呤0.75mg/L和萘乙酸0.03mg/L，pH值为5.8；
[0030]M4培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6
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苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙
酸0.03mg/L、羧苄西林300
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列，其特征在于，所述靶序列包括SEQ ID NO：1
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5中的至少一种。2.一种CRISPR/Cas9表达载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9表达载体包含权利要求1所述的靶序列。3.一种高含量萝卜硫苷芥蓝的创制方法，其特征在于，所述创制方法为：利用权利要求1所述的靶序列构建CRISPR/Cas9表达载体后进行遗传转化。4.根据权利要求3所述的创制方法，其特征在于，所述靶序列为以下任意一种：(1)SEQ ID NO：1
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5中的任意一种；(2)SEQ ID NO：1
‑
5的任意相同或不相同的两种串联而成；(3)SEQ ID NO：1
‑
5的任意相同或不相同的三种串联而成。5.根据权利要求3所述的创制方法，其特征在于，所述构建CRISPR/Cas9表达载体的步骤为：(1)根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo DNA序列，并在其5
’
端分别添加酶切位点，退火复性得到具有粘性末端的DNA双链序列；(2)采用限制性内切酶Bbs I酶切pSG载体，获得酶切产物；(3)将步骤(2)所述酶切产物与步骤(1)所述DNA双链序列进行连接后，转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，挑取单菌落进行震荡培养，获得pSG
‑
Target重组质粒；(4)使用EcoR I
‑
HF和Xba I内切酶，将步骤(3)所述的pSG
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Target重组质粒、pCC质粒分别进行双酶切，获得酶切产物；(5)将步骤(4)所述的酶切产物进行连接，获得pCC
‑
Target
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sgRNA载体，转化农杆菌感受态，获得芥蓝Target
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CRISPR/Cas9表达载体。6.根据权利要求3所述的创制方法，其特征在于，所述遗传转化为农杆菌介导的遗传转化。7.根据权利要求6所述的创制方法，其特征在于，所述农杆菌介导的遗传转化的具体步骤为：(1)将芥蓝种子表面消毒后，接种于M1培养基上生长；(2)切取无菌苗带柄子叶，接种于M2培养基上生长；(3)取芥蓝CRISPR/Cas9表达载体，接种于含抗生素的LB或YEB固体培养基上获得单克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙勃，张芬，袁巧，黄文莉，郑好，狄红梅，梁莎，王依霖，李香香，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：