一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用，属于生物工程技术领域，包括以下步骤：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3

【技术实现步骤摘要】
一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体属于一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]从1928年英国科学家弗莱明发现了青霉素开始，抗生素在对抗病魔的应用上已经八十多年之久，然而毫无节制的使用抗生素使得目前抗生素的药效减弱，而细菌的耐药性增强。在中国每年生产抗生素原料大约21万吨，除去原料出口大概3万吨之外，其与的18万吨在国内使用，包括在医疗与农业等领域的使用，中国研制一个抗生素大约需要十年时间，而产生耐药菌素却在两年之内。然而现在抗生素的开发正变得越来越难，而多种类抗生素的全民式滥用，催生病菌的强耐药能力，这使得医生也对它们几乎束手无策。
[0003]目前，抗生素的滥用问题及其严重，抗生素的残留以及微生物产生耐药性的问题很是突出，细菌性的疾病感染问题再次威胁到人类的生命健康。而随着细菌抗药性继续增强，新的“超级细菌”还会陆续出现，如果不对抗生素使用加以有效控制的话，很有可能真的出现无药可用的局面。
[0004]抗菌肽作为短肽，具有易被降解，而且不易产生耐受性，抗菌效果良好等特点，有望成为替代抗生素的新型替代物而被广泛研究。目前，抗菌肽的制备主要有从动植物原料提取、化学合成及基因工程表达三种生产手段。然而，由于动植物原料提取以及化学合成的生产制备产量低，成本较高，很难进行大规模生产，尚未实现其产业化。再者也不能一味追求抗菌效果，还需要考虑抗菌肽的溶血率，因此，到目前为止，很难找到真正适合、具有良好应用前景的抗菌肽。

技术实现思路
<br/>[0005]针对
技术介绍
中存在的缺陷和不足，本专利技术提供了一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，通过该制备方法能够大大提高抗菌肽的产量，且制备相对精简，有利于降低生产成本。
[0006]本专利技术的目的之二是将上述一种水貂蛙抗菌肽的制备方法制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物中，从而有利于减少抗生素的使用，且对环境更友好。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0008]一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
[0009]抗菌肽多聚体的设计：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3
′
端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；
[0010]抗菌肽多聚体的融合表达：将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX
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4T
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2载体上，并与PGEX
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4T
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2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白，且所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间通过Gly和Arg进行连接；
[0011]水解与去除标签：将所述抗菌肽多聚体融合蛋白通过凝血酶进行水解，上GST标签
亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。
[0012]进一步所采取的措施是：所述[D4K]B2RPR进行四次重复串联，形成所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLR。
[0013]进一步所采取的措施是：还包括步骤：偏好密码子优化：将设计好的所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化，并进行核苷酸序列合成，并在所述核苷酸序列两端引入BamH I和EcoR I位点。
[0014]进一步所采取的措施是：所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化得到核苷酸序列如SEQ 1。
[0015]进一步所采取的措施是：还包括步骤：通过双酶切和PCR进行重组子验证：设计一对引物进行重组子鉴定，其中上游引物位于抗菌肽多聚体上，下游引物位于PGEX
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4T
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2载体上；然后将含抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM基因序列的载体和PGEX
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4T
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2载体均用BamH I和EcoR I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定。
[0016]进一步所采取的措施是：所述引物扩增片段大小为368bp，且引物序列分别如下：
[0017]F：5'——ATCAAAAGCATGGGCAAGGTT——3'；
[0018]R：5'——CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT——3'；
[0019]所述重组子以F、R为引物进行PCR反应,PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。
[0020]进一步所采取的措施是：所述抗菌肽多聚体的融合表达步骤中，利用PGEX
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2载体上的酶切位点BamH I和EcoR I将所述核苷酸序列插入到PGEX
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2载体，并导入大肠杆菌BL21中。
[0021]进一步所采取的措施是：将含有所述核苷酸序列的大肠杆菌BL21，转入2*YT培养基中进行发酵培养，并待OD600数值接近1.5的时候加入IPTG，进行诱导培养6个小时。
[0022]进一步所采取的措施是：所述水解与去除标签步骤中，将诱导培养6个小时后的产物通过GST标签亲和层析，获得纯化后的抗菌肽多聚体融合蛋白。
[0023]将上述一种水貂蛙抗菌肽的制备方法制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物。
[0024]为了尽可能简化抗菌肽的制备工序，降低生产升本，并有效提高抗菌肽的产量，形成产量化生产和供给抗菌肽，进而可以减少使用抗生素甚至可以替代抗生素，避免抗生素滥用和耐药病菌的爆发，本专利技术团队经过长期研究，发现并提供了一种新的抗菌肽生产表达方式，利用该方式进行制备抗菌肽，可以大大降低抗菌肽表达过程中对宿主的抑制能力，显著提高抗菌肽的产量，并且该抗菌肽由氨基酸构成，容易被降解，无残留，对环境影响相对较小。
[0025]本专利技术通过长期研究各类抗菌物质，发现可以利用来自蛙皮肤分泌物中分离出来的抗菌肽[D4K]B2RP。C末端a酰胺化的brevinin
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2相关肽首次从水貂蛙的皮肤分泌物中分离，B2RP来源于该肽，并与广泛分布的brevinin
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2抗菌肽家族的肽序列相似，但是缺乏C端环七肽结构。而[D4K]源自该种抗菌肽与起始发现的B2RP氨基酸序列的差异为：第四个氨基酸原本为D，而该种抗菌肽的第四个氨基酸为K，所以全称为[D4K]B2RP。而[D4K]B2RPR则是在[D4K]B2RP序列的3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：抗菌肽多聚体的设计：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3
′
端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；抗菌肽多聚体的融合表达：将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX
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2载体上，并与PGEX
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2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白，且所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间通过Gly和Arg进行连接；水解与去除标签：将所述抗菌肽多聚体融合蛋白通过凝血酶进行水解，上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。2.根据权利要求1的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述[D4K]B2RPR进行四次重复串联，形成所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLR。3.根据权利要求2的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括步骤：偏好密码子优化：将设计好的所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化，并进行核苷酸序列合成，并在所述核苷酸序列两端引入BamHI和EcoRI位点。4.根据权利要求3的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化得到核苷酸序列如SEQ1。5.根据权利要求4的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建桦，张丽君，吴卫佳，唐勇军，刘小龙，林瑞鑫，罗子凡，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：