一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒、检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒，包括DMD基因第47号外显子区PCR扩增及测序引物、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂。本发明专利技术的检测方法包括：S1：DNA的提取；S2：采用MLPA对上述步骤得到的DNA进行基因突变的检测，得到DMD基因外显子区突变的具体位置；S3：通过PCR扩增并进行测序来验证上述步骤的检测结果；S4：进行预测，得出X连锁DMD基因突变体序列及其有害性预测。本发明专利技术在检测DMD基因突变体方面的应用。本发明专利技术利用MLPA技术联合Sanger测序对DMD进行基因突变检测，能够精确检测出DMD基因突变的位点，能够突变类型快速选择合适的治疗方案。

【技术实现步骤摘要】
一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒、检测方法及其应用
本专利技术属于生物医疗诊断
，具体涉及一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒、检测方法及其应用。
技术介绍
杜氏肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)是一种由编码抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)的基因DMD突变引起的罕见的X连锁的致命性退行性神经肌肉疾病。美国近年统计表明DMD在活产男婴中发病率为1/5000，它的疾病进程是进行性的，开始于9至14岁之间的活动能力下降，其次是呼吸系统并发症和心脏功能下降，并最终在20岁左右死于呼吸衰竭或心力衰竭。骨骼肌疾病多采用肌肉活检作为确诊方法，典型的DMD患者的腓肠肌活检会发现大量脂肪组织和纤维结缔组织增生，出现肌纤维肥大、增生、分裂，变性、坏死和吞噬等现象。肌肉活检能对疾病的轻重做出判断，但不能明确基因突变的位置和类型，不能指导基因水平的精准治疗。根据2010年国际DMD诊断和管理指南，临床上肌活检为阳性时也应进行基因检测，以便为患者进行遗传咨询和产前诊断并根据基因突变类型提供基因突变特异性治疗方案；同时，若没有做肌活检，基因检测阳性者可直接确诊。因此，为患者做出基因分析，既可明确诊断，也可作为精准医疗的最重要依据。临床上DMD的基因检测目前常采用多重连接探针扩增技术(Multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)，该技术可快速检测出DMD基因突变大片段缺失和拷贝数变异；当MLPA结果为阴性时，需要采用第二代测序技术(Nextgenerationsequencing,NGS)，可以检测点突变及拷贝数突变，作为MLPA阴性时的有效补充；当MLPA显示单个外显子缺失时，可能是该外显子上存在点突变，导致假阳性，需要采用Sanger测序进行验证，并准确找出点突变。关于DMD的治疗，目前临床上综合采用多学科的理念和技术，通过药物和管理可以减缓病情的进展，目的是延长患者的生命和提高其生活质量，但不能根治，因此产前进行遗传咨询，通过产前基因筛查防止患儿出生具有重要意义，同时目前已有多种在基因水平的精确疗法处于临床试验阶段，可能会给DMD患者带来治疗希望，因此对已出生的DMD患者早期的基因诊断也尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒、检测方法及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒，包括DMD基因第47号外显子区PCR扩增及测序引物、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；其中DMD基因第47号外显子区PCR扩增及测序引物为：F：5'-ggccctcggtcaagtcgc-3'；R：5'-agccaaagcaaacggtcagg-3'；所述X连锁DMD基因突变体的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。SEQIDNO1：ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAGAGGACTGTTATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAACATTCACAAAATGGGTAAATGCACAATTTTCTAAGTTTGGGAAGCAGCATATTGAGAACCTCTTCAGTGACCTACAGGATGGGAGGCGCCTCCTAGACCTCCTCGAAGGCCTGACAGGGCAAAAACTGCCAAAAGAAAAAGGATCCACAAGAGTTCATGCCCTGAACAATGTCAACAAGGCACTGCGGGTTTTGCAGAACAATAATGTTGATTTAGTGAATATTGGAAGTACTGACATCGTAGATGGAAATCATAAACTGACTCTTGGTTTGATTTGGAATATAATCCTCCACTGGCAGGTCAAAAATGTAATGAAAAATATCATGGCTGGATTGCAACAAACCAACAGTGAAAAGATTCTCCTGAGCTGGGTCCGACAATCAACTCGTAATTATCCACAGGTTAATGTAATCAACTTCACCACCAGCTGGTCTGATGGCCTGGCTTTGAATGCTCTCATCCATAGTCATAGGCCAGACCTATTTGACTGGAATAGTGTGGTTTGCCAGCAGTCAGCCACACAACGACTGGAACATGCATTCAACATCGCCAGATATCAATTAGGCATAGAGAAACTACTCGATCCTGAAGATGTTGATACCACCTATCCAGATAAGAAGTCCATCTTAATGTACATCACATCACTCTTCCAAGTTTTGCCTCAACAAGTGAGCATTGAAGCCATCCAGGAAGTGGAAATGTTGCCAAGGCCACCTAAAGTGACTAAAGAAGAACATTTTCAGTTACATCATCAAATGCACTATTCTCAACAGATCACGGTCAGTCTAGCACAGGGATATGAGAGAACTTCTTCCCCTAAGCCTCGATTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCTTATGTCACCACCTCTGACCCTACACGGAGCCCATTTCCTTCACAGCATTTGGAAGCTCCTGAAGACAAGTCATTTGGCAGTTCATTGATGGAGAGTGAAGTAAACCTGGACCGTTATCAAACAGCTTTAGAAGAAGTATTATCGTGGCTTCTTTCTGCTGAGGACACATTGCAAGCACAAGGAGAGATTTCTAATGATGTGGAAGTGGTGAAAGACCAGTTTCATACTCATGAGGGGTACATGATGGATTTGACAGCCCATCAGGGCCGGGTTGGTAATATTCTACAATTGGGAAGTAAGCTGATTGGAACAGGAAAATTATCAGAAGATGAAGAAACTGAAGTACAAGAGCAGATGAATCTCCTAAATTCAAGATGGGAATGCCTCAGGGTAGCTAGCATGGAAAAACAAAGCAATTTACATAGAGTTTTAATGGATCTCCAGAATCAGAAACTGAAAGAGTTGAATGACTGGCTAACAAAAACAGAAGAAAGAACAAGGAAAATGGAGGAAGAGCCTCTTGGACCTGATCTTGAAGACCTAAAACGCCAAGTACAACAACATAAGGTGCTTCAAGAAGATCTAGAACAAGAACAAGTCAGGGTCAATTCTCTCACTCACATGGTGGTGGTAGTTGATGAATCTAGTGGAGATCACGCAACTGCTGCTTTGGAAGAACAACTTAAGGTATTGGGAGATCGATGGGCAAACATCTGTAGATGGACAGAAGACCGCTGGGTTCTTTTACAAGACATCCTTCTCAAATGGCAACGTCTTACTGAAGAACA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒，其特征在于：包括DMD基因第47号外显子区PCR扩增及测序引物、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；/n其中DMD基因第47号外显子区PCR扩增及测序引物为：/nF：5'-ggccctcggtcaagtcgc-3'；/nR：5'-agccaaagcaaacggtcagg-3'；/n所述X连锁DMD基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒，其特征在于：包括DMD基因第47号外显子区PCR扩增及测序引物、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；
其中DMD基因第47号外显子区PCR扩增及测序引物为：
F：5'-ggccctcggtcaagtcgc-3'；
R：5'-agccaaagcaaacggtcagg-3'；
所述X连锁DMD基因突变体的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。


2.根据权利要求1所述的一种X连锁DMD基因突变体的检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括2×TSINGKEMasterMix、ddH2O。


3.一种根据权利要求1所述的X连锁DMD基因突变体的检测方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
S1：DNA的提取：从样品血液中提取DNA，-20℃保存待用；
S2：采用MLPA对上述步骤得到的DNA进行基因突变的检测，得到DMD基因外显子区突变的具体位置；
S3：设计DMD基因碱基缺失的外显子区PCR扩增及测序引物，通过PCR扩增并进行测序来验证上述步骤的检测结...

【专利技术属性】
技术研发人员：程翔，查灵凤，陈倩文，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42