一种三七诱导型启动子PPO1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种三七诱导型启动子PPO1及其应用，PPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明专利技术通过分子生物学和基因工程相关技术研究证实三七启动子PPO1响应几种植物激素、生物胁迫和非生物胁迫。将本发明专利技术三七诱导型启动子PPO1与β‑葡萄糖苷酸酶基因构建的表达框转入烟草中表达，通过荧光法定量检测转基因烟草的葡萄糖苷酸酶活性，结果表明转基因烟草在赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、受伤、茄腐镰刀菌、链格孢处理后葡萄糖苷酸酶活性明显增强。由此可见三七启动子PPO1受几种激素、生物和非生物胁迫因子的诱导，能用于植物抗逆境基因工程。

【技术实现步骤摘要】
一种三七诱导型启动子PPO1及其应用
本专利技术涉及分子生物学以及基因工程相关研究领域，具体涉及一种三七诱导型启动子PPO1及其应用。
技术介绍
植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列。启动子是基因转录的调控中心，它像“开关”，控制基因表达的起始时间和程度。启动子组成不仅包括CAAT-box、TATA-box等基本作用元件，还包括某些响应逆境胁迫的顺式作用元件，以确保能够受到环境、外源处理等因素影响来调控基因在不同条件下转录。植物启动子按其转录方式可以分为：组成型启动子(基因的表达不受时空限制和外源因素的控制)、诱导型启动子(基因的表达受外源物理、化学因素的诱导，没有诱导物存在，基因表达水平很低甚至没有)和组织特异性启动子(基因的表达分布在植物的某个组织或器官中)。组成型启动子能在不同类型的细胞及细胞发育的不同阶段，持续高效地驱动基因转录，并且转录活性相对恒定，典型的是花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus，CaMV)35S启动子，被广泛应用于双子叶植物转基因工程。但若目的基因在植物的整个生命周期中都高强度表达，会导致基因产物过度累积造成资源的非必要浪费，同时大量异源蛋白的积累也会打破植物原有的代谢平衡，阻碍植物的正常生长，随之而来的代谢紊乱甚至植物死亡。为了改善这个问题，组织特异性启动子与诱导型启动子的开发利用成为基因工程研究的一个热点。诱导型启动子是在植物适应环境和长期进化过程中形成的，能够响应特殊的生物、物理、化学信号，进而提高特定基因转录水平，来适应一定范围内环境变化的一类启动子。在没有诱导因子存在的条件下，它控制的编码基因不表达或本底表达。一旦环境中出现诱导因子，编码基因表达迅速增加，在去除诱导因子后又会停止对基因的调控。在载体上加入诱导型启动子可以在外界刺激时调控目的基因的表达，很好地解决了外源基因无限制表达的问题。并且诱导型启动子驱动外源基因的表达受特定的物理或化学信号控制，该特点使外源基因的表达可以得到更为精细的控制（杨瑞娟,白建荣,李锐,常利芳.诱导型启动子在植物基因工程中的研究进展.山西农业科学,2018,46(02):292-298）。目前诱导型启动子已在各植物中有了应用，如在水稻（Oryzasativa）中OsAAA1基因是一个具有诱导抗性的新基因，对稻瘟病（Magnaportheoryzae）和白叶枯病（Xanthomonasoryzaepv.oryzae）均具有很强的抗性。为了研究其功能和抗病机理，Wang等构建了诱导型启动子载体PPR1b-ADH-OsAAA1，该诱导型启动子能显著降低由于抗性基因的表达而引起的对植株农艺性状的不良影响，当对阳性植株进行稻瘟病菌的诱导表达，并通过qPCR检测OsAAA1基因表达量的变化，结果表明诱导型启动子融合载体PPR1b-ADH-OsAAA1成功受到稻瘟病菌的诱导，OsAAA1的表达量显著上升（WangZ,ChenJ,WangC,LiuX.GenetictransformationandinductionexpressionofpromoterstructureofriceresistancegeneOsAAA1.MolecularPlantBreeding,2018,16(21):7021-7026）。从斑茅(Erianthusarundinaceus)中克隆得到的PR10启动子，连接报告基因GUS后转入烟草，水稻和甘蔗（Saccharumofficinarum）。GUS酶活测定结果表明，伤胁迫、茉莉酸甲酯和脱落酸处理诱导了斑茅PR10启动子的表达（ChakravarthiM,SyamaladeviDP,HarunipriyaP,AugustineSM,SubramonianN.AnovelPR10promoterfromErianthusarundinaceusdirectshighconstitutivetransgeneexpressionandisenhanceduponwoundinginheterologousplantsystems.MolBiolRep,2016,43(1):17-30）。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种诱导型启动子PPO1，来源于三七，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术另一目的是将该启动子应用在基因工程中，即在生物胁迫下作为诱导表达启动子调控外源基因在转基因受体植物中的特异高效表达。本专利技术涉及分离诱导型启动子片段并鉴定其表达活性，本专利技术从三七中克隆获得诱导型启动子，该启动子长965bp。将本专利技术分离克隆的诱导型启动子片段置换pBI121载体上的CaMV的35s启动子，由诱导型启动子驱动报告基因GUS的表达框，通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导将其转入模式植物烟草(Nicotianatabacum)中表达，并通过进一步实验揭示诱导型启动子的表达特性，为后期利用该启动子调控外源基因在转基因植株中的高效特异表达奠定基础，专利技术人将这个启动子命名为PPO1。将本专利技术中PPO1启动子驱动GUS的表达框转入烟草中，采用植物激素、生物胁迫和非生物胁迫处理转基因烟草植株，并进行GUS活性的荧光定量分析，检测结果表明，PPO1启动子响应几种植物激素、生物胁迫和非生物胁迫的处理，脱落酸、吲哚乙酸、赤霉素、伤害胁迫、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、链格孢(Alternariacompacta)能明显诱导启动子PPO1的活性。上述启动子PPO1可以在基因工程中应用于外源基因的诱导表达，具体操作如下：（1）从三七幼嫩组织中提取基因组DNA，采用扩增PPO1的特异引物，通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)扩增出PPO1序列，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有序列正确的克隆；（2）用限制性内切酶酶切pGEM-T-PPO1载体，回收启动子片段；同时采用合适的限制性内切酶酶切去除植物表达载体上的组成型表达启动子，通过胶回收得到载体大片段；再将所获得PPO1片段与pBI121-GUS载体片段连接，构建植物诱导表达载体；之后将所构建的植物诱导表达载体通过根癌农杆菌介导转入受体植物中；表达转基因的植株在遭受伤害胁迫或茄腐镰刀菌、致密链格孢侵染时，启动子PPO1驱动的目的基因会被诱导并上调表达水平，此外体内体外的脱落酸、吲哚乙酸、赤霉素也会诱导目的基因高水平表达。基因工程中植物超表达载体常用来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，该启动子为组成型表达启动子，目的基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异，所以转入植物的外源基因的表达不受控制，导致蛋白大量积累且浪费能量。而诱导型启动子可以在植物受到外界胁迫或化学因素影响时提高目的基因的表达量，在去除胁迫或化学处理后即下调目的基因的表达，可保证在植物受到逆境胁迫时起到保护植物、抵抗外界刺激的效果，反之在适宜的环境中不浪费植物的能量。此外，在基因工程应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导型启动子PPO1，来源于三七，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导型启动子PPO1，来源于三七，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.权利要求1所述的诱导型启动子PPO1在植...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，郑锂蕾，梁婷婷，苏琳琳，邓婕，葛锋，崔秀明，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53