一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂，属于生物技术领域。该间充质干细胞的分离方法包括以下步骤：将滑膜组织剪碎，并置于完全培养基中后，再添加胶原酶溶液进行消化、震荡分散，得到沉降组织和第一上清液；将沉降组织置于完全培养基中进行震荡分散，重复两遍，所得上清液均与第一上清液进行混合，再对上清液进行过滤，得到滤液；将滤液进行离心处理，弃上清，分离得到原代间充质干细胞。将原代间充质干细胞通过2D纯化培养后进行3D扩增培养，获得大量纯度高、分化能力强的滑膜间充质干细胞。本发明专利技术提供的间充质干细胞的分离和培养方法，采用的试剂较少，避免了多种酶混合消化对细胞造成的多次损伤。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂
本专利技术涉及生物
，具体是一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂。
技术介绍
骨关节炎为中老年常见病，骨关节炎严重降低了老年人的生活质量，同时也给社会经济医疗保健带来沉重的负担，研究骨关节炎的治疗方法已成为解决我国民生大计的重要内容之一。骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨的磨损、破坏、丢失，并伴有关节周围骨质增生的一种退行性疾病，主要表现为关节疼痛及功能障碍，目前的治疗手段仅起到缓解的效果，不能有效逆转其进展。研究发现，OA患者滑膜中广泛分布着表达间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)标志物的细胞，而在健康关节滑膜中这种细胞仅分布在衬里层。已证实，滑膜间充质干细胞（synovium-derivedmesenchymalstemcells，SMSCs）除具有MSCs的共性外，相比其他来源的MSCs有更好的成软骨分化能力，以及更强的集落形成和扩增能力。此外，滑膜组织具有很强的自我修复能力，即便受到一定的手术创伤或化学损伤，滑膜组织也能够完全恢复，且不会对关节的正常结构和功能等产生十分明显的影响。所以，利用SMSCs治疗OA，采集标本时，以不损伤患者关节正常结构和功能为前提，可以在微创手术（关节镜）过程中获得所需的滑膜组织。动物来源（包括大鼠滑膜和兔滑膜等）的SMSCs已应用于同种异体组织工程动物模型的实验研究中，在动物软骨缺损最深层，SMSCs分化为骨细胞，次深层分化为肥大的软骨细胞，且新生组织与固有软骨融合良好，组织学评分逐渐升高；也有报道移植SMSCs后，SMSCs分泌了大量软骨基质，骨膜处的软骨祖细胞能分泌少量软骨基质。进一步研究发现滑膜间充质干细胞修复形成的组织是透明软骨而非纤维软骨，并且滑膜间充质干细胞更能适应关节内的微环境。说明SMSCs对于软骨损伤具有天然且有效的修复能力，是彻底根治OA的极为有效的理想选择，有必要对其进行提取制备及深入研究。目前对于SMSCs的研究很少，文献报道的分离提取SMSCs的方法不尽相同，也没有统一的分离制备标准，且现有分离提取SMSCs的方法存在培养周期长，产量低，所采用试剂较多等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤：将滑膜组织剪碎，并置于完全培养基中后，再添加胶原酶溶液进行消化、震荡分散，得到沉降组织和第一上清液。将沉降组织置于完全培养基中进行震荡分散，得到上清液与第一上清液混合。将沉降组织再次置于完全培养基中进行震荡分散，得到上清液与上述上清液混合。对所得上清液进行过滤，得到滤液。将滤液进行离心处理，弃上清，得到原代间充质干细胞。作为本专利技术实施例的一个优选方案，所述胶原酶溶液的制备方法包括以下步骤：将胶原酶溶解于完全培养基中后，再经滤膜过滤，得到所述胶原酶溶液。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述胶原酶溶液中，胶原酶的质量与完全培养基的体积的比值以g/mL计为(0.5~1.5):100。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述完全培养基为添加有血清替代品和L-谷氨酰胺的Lonza无血清培养基。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述步骤中，过滤的方法为采用60~80μm的细胞滤网进行过滤。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种间充质干细胞的培养方法，其包括以下步骤：将上述分离方法得到的细胞用原代培养基进行重悬后，再进行培养、换液，弃去未贴壁细胞；待原代细胞的融合度不低于60%时，将其进行传代培养，得到P1代细胞。待P1代细胞的融合度不低于80%时，将其进行传代培养，直至得到单一的梭形成纤维样的P3代细胞。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述原代培养基包括完全培养基和青霉素-链霉素混合液；青霉素-链霉素混合液和完全培养基的体积比为1:100。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述青霉素-链霉素混合液的浓度为10000单位/mL。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述培养方法还包括以下步骤：取3D微载片作为培养的微载体。用胰酶替代物对P3代细胞进行消化，得到细胞悬液。将微载体置于完全培养基进行分散后，再添加悬液进行培养。培养结束后添加载体裂解液将细胞洗脱下来，收集液体，经离心得到3D扩增培养的间充质干细胞。其中，3D细胞培养技术既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。3D支架为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，对后续的研究和临床应用更有利。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种上述培养方法得到的制剂。与现有技术相比，本专利技术实施例的有益效果是：本专利技术实施例提供了一种间充质干细胞的分离和培养方法，采用的试剂较少，避免了多种酶混合消化对细胞造成的多次损伤，另外，胶原酶使用含血清替代物的培养基配制，在组织间质被消化过程中血清能有效保护细胞的完整性，保证细胞活力。特别地，通过将2D培养与3D培养模式有机结合，不但纯化了细胞而且最大程度保留了细胞在体内环境下的特性，同时短时间内可获得足够数量的细胞，更有利于滑膜间充质干细胞的研究和临床应用。具体的，本专利技术相较于常规分离培养间充质干细胞的方法，优点在于：一是采用的试剂较少，避免了多种酶混合消化对细胞造成的多次损伤；二是胶原酶使用含血清替代物的培养基配制，先配置成高浓度母液，使用时再次用含血清替代物的培养基稀释成工作浓度，在组织间质被消化过程中血清能有效保护细胞的完整性，保证细胞活力；三是本方法在含血清替代物的环境中分离的滑膜间充质干细胞贴壁能力更强，贴壁率高；四是由于分离提取的细胞除滑膜间充质干细胞外还包括巨噬细胞样滑膜细胞，本方法能有效去除杂质细胞，更容易获得高纯度的滑膜间充质干细胞，且细胞生长状态均一，便于培养扩增；五是分离培养全过程均无动物源性成分，如无血清培养基、胰酶替代物、医药辅料级微载体，所以细胞安全性高，便于进行体内研究应用；六是培养中引入3D培养方式，促进细胞的贴附、散布、迁移、增殖和分化，不仅大大提高了细胞的产量，更增加了如II型胶原、蛋白聚糖和软骨寡聚基质蛋白等基因的表达，使滑膜间充质干细胞更易向软骨分化；七是本方法分离和培养的滑膜间充质干细胞纯度高、活率高、活力强；八是本方法根据各阶段细胞培养的侧重点将2D培养与3D培养方式有机结合，充分发挥了不同细胞培养方式的优点，也最大限度保护和增强了细胞的特性。附图说明图1为实施例1培养至P4代的滑膜间充质干细胞72h生长形态（40×）。图2为实施例1培养至P4代的滑膜间充质干细胞的活率及计数结果图。图3为实施例1培养至P4代的滑膜间充质干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：/n将滑膜组织剪碎，并置于完全培养基中后，再添加胶原酶溶液进行消化、震荡分层，得到沉降组织和第一上清液；/n将沉降组织置于完全培养基中进行震荡分散两遍，得到上清液；/n将所有上清液进行混合后，再进行过滤，得到滤液；/n将滤液进行离心处理，弃上清，得到原代间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
将滑膜组织剪碎，并置于完全培养基中后，再添加胶原酶溶液进行消化、震荡分层，得到沉降组织和第一上清液；
将沉降组织置于完全培养基中进行震荡分散两遍，得到上清液；
将所有上清液进行混合后，再进行过滤，得到滤液；
将滤液进行离心处理，弃上清，得到原代间充质干细胞。


2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述胶原酶溶液的制备方法包括以下步骤：将胶原酶溶解于完全培养基中后，再经滤膜过滤，得到所述胶原酶溶液。


3.根据权利要求2所述的一种间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述胶原酶溶液中，胶原酶的质量与完全培养基的体积的比值以g/mL计为(0.5~1.5):100。


4.根据权利要求1~3中任一项所述的一种间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述完全培养基为添加有血清替代品和L-谷氨酰胺的Lonza无血清培养基。


5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤中，过滤的方法为采用60~80μm的细胞滤网进行过滤。


6.一种间充质干细胞的培养方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵莹，朱艳丽，聂苏秦，
申请(专利权)人：陕西九州生物医药科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61