流感核蛋白疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种融合蛋白，其包含来自流感病毒株A、B或C的核蛋白抗原的变体和C4bp寡聚化域的变体，用于增加来自流感的核蛋白抗原的细胞免疫原性。本发明专利技术还涉及核酸、载体、融合蛋白和免疫原性组合物，它们用作疫苗或免疫疗法用于预防和治疗流感疾病。

【技术实现步骤摘要】
流感核蛋白疫苗本申请是申请日为2014年3月18日，申请号为201480013364.1，专利技术名称为流感核蛋白疫苗的专利申请的分案申请。背景存在改进流感疫苗的需要。目前针对流感的疫苗策略集中在生成针对血凝素的稳固的抗体(体液的)反应。由于在一年的过程中循环流感病毒株中高度的抗原性漂移，对于每个流感季必须特定地重新配制疫苗株。虽然年度(或季度)流感疫苗对于不同年龄类别的变化程度是成功的，显然对于年幼和年老者特别需要更有效的保护。此外，存在再造病毒会进化的重大、永久的风险，其在称为“抗原性漂移”的过程中获得非常不同的HA(血凝素)基因。这会产生公共健康紧急情况，因为目前的流感疫苗基本上依赖于HA抗原。流感病毒是病毒的正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中一种有包膜的、单链、负链RNA病毒，分为3个主要类型A、B和C。流感A病毒感染多种多样的动物，包括人、鸟类、猪、马、蝙蝠等等，尽管任何特定的流感病毒的趋向性通常高度适应于特定宿主。流感B病毒感染较小数目的物种，即人和海豹，但仍然是年度流行性感冒的重要原因。大多数人流感感染是通过流感病毒A或B引起的；而感染人和猪的流感C病毒罕见导致严重的人感染或流行(Lamb)。目前失活的流感病毒疫苗诱导抵御紧密相关的病毒株的抗体。目前得到许可的疫苗主要诱导针对血凝素(HA)的菌株-特异性的中和抗体，病毒表面上的主要抗原性决定簇其为高免疫原性的，并可预防由匹配病毒株的感染引起的疾病。然而，HA具有重要的抗原变异，其排除其单独用于经设计以提供光谱防护(broadprotection)的疫苗。为此，针对较少可变的靶物生成保护反应的可替换的疫苗策略是非常感兴趣的。用流感A病毒的天然感染诱导体液和细胞免疫性两者。持久的细胞免疫性主要针对保守的、内部病毒蛋白，如核蛋白(NP)。在天然感染后NP抗原在人中是免疫原性的，但诱导的细胞毒性T淋巴细胞具有短的寿命(McMichaela,McMichaelb)。针对NP的细胞免疫性是有价值的，因为其针对NP表位的不同变体，且靶向NP的DNA疫苗在动物中具有诱导的交叉-保护的免疫性(Schotsaert)。核蛋白(NP)抗原已长期被识别为高度保守的抗原：甚至是最歧化的(divergent)流感病毒A株在它们编码的NP蛋白中共享90％同一性(Gorman,Xu)。对NP的抗原性变化是罕见的且仅仅在较小程度发生(Staneková)。现有技术使用核蛋白作为疫苗中的抗原流感核蛋白用作抗原描述于1980年代(Wraith)。小鼠中针对NP的细胞免疫响应能够诱导免疫性，且能够显著地产生针对分歧的A型病毒的交叉保护。显示用由H3N2病毒纯化的NP免疫小鼠可提供免于致死性异源(H1N1)攻击的实质保护(75％)，但它不能防止感染。使用NP基因的DNA疫苗已知20年：将它们用于第一“概念证明”实验用于DNA免疫本身(Ulmer)。NP从病毒载体的表达首次在1980年代证明(Yewdell1985)，且用此载体免疫与细胞毒性T淋巴细胞针对分歧的流感病毒A株而非B株与DNA疫苗相比改进的生成相关。自此，已显示用表达PR8核蛋白的MVA载体免疫小鼠保护它们抵御异亚型流感病毒(Altstein)的低剂量攻击。更近些，已将一种编码融合于M1蛋白的NP蛋白的病毒载体用于免疫人(Lillie,Berthoud,Antrobus)。这些研究显著地显示：当体液反应通过免疫衰老(immunosenescence)下降时，对于NP的细胞免疫响应可在较年长的人中被实质地增强(Antrobus)。核蛋白的分泌一些研究已表明NP蛋白起初位于核中，减少这些DNA疫苗的免疫原性(Staneková)。改进的针对NP的细胞免疫响应可通过强制分泌NP，例如通过将tPA信号肽融合于NP基因(Luo)、通过配制DNA(Greenland,Sullivan)以及通过使用电穿孔(Laddy)以改进DNA递送来获得。单体流感核蛋白单体抗原在与C4bp寡聚域的融合体中的优选使用描述于专利申请WO2005/014654中。但单体化抗原使用中的风险是它们降低的免疫原性。这由Bachmann和同事用水泡性口膜炎病毒的糖蛋白G证明(Bachmann1993)，并且用于流感抗原神经氨酸酶，或NA，由Fiers和同事证明(Fiers2001)。可预期的是减少或去除来自流感核蛋白的更高级结构会降低它们的免疫原性。已显示多种突变使流感核蛋白转变，其自然寡聚化为单体形式(Ye2006)。在此2006文章中所述的NP的单体形式在更近期的文章中确认为单体的(Tarus,Ye2012)。这些文章中所述的赋予流感病毒A株的核蛋白单体的两个点突变在流感病毒B和C株的核蛋白中是保守的(参见Nakada中图3)。因此，可将相同的点突变引入流感病毒B和C株的核蛋白，从而赋予这些其他流感核蛋白单体。但是没有进行单体核蛋白的免疫原性的研究。用NP抗原制备流感疫苗中的主要技术问题是诱导强而且持久的细胞免疫响应。所述“细胞免疫响应”是一种免疫响应，其不涉及抗体，但涉及抗原-特异性T-淋巴细胞(且特别是细胞毒性T淋巴细胞)的活化和多种细胞因子响应于抗原的释放。CD4细胞或辅助性T细胞通过分泌活化免疫响应的细胞因子而提供针对不同病原体的保护。细胞毒性T细胞(CD8)引起由于病原体的凋亡所致的死亡而不需使用细胞因子。尽管对于针对NP的CD4或CD8响应是否对于保护是更重要的仍然有争议(Epstein)，但存在共识，即对于核蛋白的细胞反应而非体液反应对于此抗原可诱导的保护是关键的(Thomas)。当T细胞表位源自高度保守的NP蛋白时，通过引发强细胞毒性T细胞响应提供保护的疫苗可为有用的(Epstein；Roy)。由T淋巴细胞介导的细胞免疫响应主要通过识别流感病毒-感染的细胞、通过抑制病毒复制以及通过加速病毒清除而发挥功能。赋予免疫性所涉及的特异性T细胞包括CD4+和CD8+T细胞两者，并常常分别通过分泌的细胞因子和细胞裂解活性的作用来发挥它们的功能。流感NP-特异性CD8+CTL特别能够在针对小鼠中致死性流感病毒攻击的异亚型保护性免疫性起重要作用(Gschoesser)，包括流感病毒从上呼吸道粘膜表面的清除(Mbawuike)，促进攻击后的存活和恢复(Epstein)。最佳的基于NP的疫苗可改进CD4和CD8细胞反应两者。本专利申请提供用于改进对于流感病毒核蛋白的细胞免疫响应的方法。专利技术简述本专利技术涉及用于增加来自流感病毒的NP抗原的免疫原性(特别是细胞免疫原性)的方法，即，将来自流感病毒株A、B或C的NP抗原的至少一种变体融合于作为载体蛋白的鸡(chicken)C4bp寡聚化域的变体。本专利技术具体涉及融合蛋白，其包含来自流感病毒株A、B或C的NP抗原的至少一个单体变体和具有如SEQIDNO:1中所示序列的载体蛋白IMX313，如专利申请WO2007/062819中所述。本专利技术具体涉及融合蛋白，该融合蛋白包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包含至少一个核蛋白(NP)抗原的变体和鸡C4bp寡聚化域的变体，其中所述鸡C4bp寡聚化域的变体为SEQ ID NO:5中所示的IMX313P，其中所述核蛋白抗原是非单体抗原。/n

【技术特征摘要】
20130318 EP 13305320.71.一种融合蛋白，其包含至少一个核蛋白(NP)抗原的变体和鸡C4bp寡聚化域的变体，其中所述鸡C4bp寡聚化域的变体为SEQIDNO:5中所示的IMX313P，其中所述核蛋白抗原是非单体抗原。


2.根据权利要求1的融合蛋白，所述NP抗原来自流感病毒株A、B或C。


3.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述核蛋白抗原包含信号肽。


4.一种核酸，其编码根据权利要求1至3中任一项的融合蛋白。


5.一种载体，其包含根据权利要求4的核酸。

【专利技术属性】
技术研发人员：J·德尔坎波阿斯卡拉泰尔，F·希尔，
申请(专利权)人：奥西瓦科斯公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR