银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用技术

技术编号:29816530 阅读:17 留言:0更新日期:2021-08-27 14:02
本发明专利技术公开了一种银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用。该生物农药包括银杏内生球黑孢菌发酵液和葡萄糖、玉米浆。抑菌实验显示,该生物农药能有效的抑制姜青枯菌的生长和繁殖,与阳性对照农用硫酸链霉素效果相当;田间试验显示,该生物农药对姜青枯病的防治达到80%以上,与农用硫酸链霉素效果相当。本发明专利技术采用银杏内生球黑孢菌发酵液制备生物农药,绿色安全无污染,且不易产生抗药性,能对姜青枯病进行有效防控。

【技术实现步骤摘要】
银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用
本专利技术属于生物农药
,具体涉及一种银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用。
技术介绍
姜青枯病,俗称姜瘟病,是由姜青枯菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种重大病害,严重影响着我国生姜的产量和品质,据调查,生姜主产区常年由于姜青枯病的危害而损失20%~30%,重者可达80%以上,且一旦大面积发病,很难采取补救措施,给姜农带来巨额损失。腐烂的生姜中还含有对人体有害的黄樟素,影响人类的健康。银杏(Ginkgobiloba)是我国有大量栽培的世界珍稀树种,在其生长过程中几不会或很少感染病虫害。一方面是由于银杏自身在代谢过程中产生的抑菌活性物质,比如银杏黄酮、内酯、银杏酸等;另一方面,与银杏共生的内生菌代谢长生的抑菌抗菌次级代谢物,二者协同对病虫害进行防御。因此,银杏提取物或银杏内生菌均可开发作为生物农药使用。但是,受限于气候、土地资源和生长周期,银杏提取物作为生物农药开发具有一定的局限性;而银杏内生菌生长繁殖速度快,不受气候、土地和生长周期限制,更具有应用开发价值。专利技术人在前期工作中筛选到一株银杏内生真菌,具有抗青枯菌的活性,经鉴定为球黑孢菌(Nigrosporasphaerica,保藏编号为CCTCCM2018755),已申请专利保护菌株(ZL201811382974.5)。实验室试验显示,该菌株对姜青枯菌具有明显的拮抗作用,是一种应用开发潜力巨大的生防菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用。一种银杏内生球黑孢菌生物农药,包括银杏球黑孢菌发酵液、葡萄糖和玉米浆。所述葡萄糖的终浓度为5-15g/L。所述葡萄糖的终浓度为0.5-2g/L。所述银杏内生球黑孢菌生物农药的制备方法,按照如下步骤进行:(1)银杏球黑孢菌的活化:取-80℃保藏的菌株,用接种环挑取孢子,在PDA斜面培养基上划线,在28℃恒温培养箱中培养5-7天,直至试管中长满菌丝;(2)种子液的制备:用接种环取活化的菌丝,接种到装有100mLPDB液体培养基的500mL规格的摇瓶中,培养20-30h;(3)发酵:采用发酵罐进行发酵,发酵培养基为PDB培养基,装液量为60%,发酵温度28-32℃,溶氧全程控制在25-35%,溶氧与转速进行关联控制,通过调节转速来控制和调节溶氧,转速设置最低600rpm,最高1200rpm;发酵120h后,待发酵液变为深红色,每隔12h取样用HPLC检测9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素(9α-hydroxydihydrodesoxybostrycin)浓度,当其浓度在1.0g/L以上,终止发酵,制成发酵液;(4)按照葡萄糖终浓度10g/L,玉米浆终浓度1g/L添加相应重量的葡萄糖和玉米浆,溶解混匀,即为制备的生物农药。所述发酵罐采用5L发酵罐。所述发酵罐的通气量为5L/min,pH7.0,分别用20%NaOH和20%磷酸溶液调节pH。所述银杏内生球黑孢菌生物农药防治姜青枯菌的用途。本专利技术的有益效果:本专利技术以专利菌株银杏内生球黑孢菌(保藏编号为CCTCCM2018755)发酵液为基础,添加辅料葡萄糖和玉米浆,制备银杏生物农药。实验室试验显示,该生物农药对姜青枯病病原菌-姜青枯菌显示出良好的拮抗效果;田间试验显示,该生物农药对姜青枯病的防治达到80%以上,与农用硫酸链霉素效果相当。因而,该生物农药对姜青枯病具有较好的防治作用。附图说明图1为银杏生物农药对姜青枯菌的抑制作用;图中,A、B:100倍稀释生物农药;C:阳性对照25μg/L农用硫酸链霉素;D:阴性对照无菌水。具体实施方式为了便于理解本专利技术,下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是,本专利技术可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。实施例1银杏生物农药的制备1、银杏球黑孢菌发酵液的制备(1)银杏球黑孢菌的活化:取-80℃保藏的菌株,用接种环挑取少许孢子,在PDA斜面培养基上划线,在28℃恒温培养箱中培养5-7天,直至试管中长满菌丝。(2)种子液的制备:用接种环在“(1)”中活化的菌丝少许,接种到装有100mLPDB液体培养基的500mL规格的摇瓶中,培养24h。(3)发酵:发酵采用5L发酵罐进行发酵(SartoriusBiostatA,德国贝朗),发酵培养基为PDB培养基,装液量为60%,接种量为10%,发酵温度30℃,通气量为5L/min,pH7.0,分别用20%NaOH和20%磷酸溶液调节pH;溶氧全程控制在30%,溶氧与转速进行关联控制,通过调节转速来控制和调节溶氧,转速设置最低600rpm,最高1200rpm。发酵120h后,待发酵液变为深红色,每隔12h取样用HPLC检测9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素(9α-hydroxydihydrodesoxybostrycin)浓度,当其浓度在1.0g/L以上,即可终止发酵。纱布过滤去除菌丝体和固体颗粒,备用。9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素HPLC分析方法:A、样品的制备:取发酵液1mL,离心后将上清液转移至2mL离心管中,然后加入1mL乙酸乙酯,振荡混匀萃取10-15min,分层后取上层液体,0.22μm滤膜过滤,即为分析样品。B、分析方法:色谱柱为Symmetry-C18色谱柱。流动相:A相为0.1M的pH6.50乙酸钠溶液,预先配制0.1M的乙酸钠溶液,用乙酸调节pH至6.5,0.22μm滤膜过滤后超声脱气备用;B相为乙腈:水=4:1溶液,按照体积比配制乙腈:水=4:1的溶液,用0.22μm滤膜过滤,流动相超声脱气备用。柱温为36℃,流速为1mL/min,进样体积:10μL,检测波长为400nm。采用等度洗脱的方法,B相浓度维持在60%进行分析,在5.432min处即可出现9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素峰。2、辅料的添加根据发酵液的体积,按照葡萄糖终浓度10g/L,玉米浆终浓度1g/L添加相应重量的葡萄糖和玉米浆,溶解混匀,即为制备的生物农药。实施例2银杏生物农药对姜青枯菌的抑制作用在实验室条件下,以农用硫酸链霉素为对照,考察本专利技术银杏生物农药对姜青枯菌的抑制效果。1、银杏生物农药的制备,按照实施例1中所述方法制备银杏生物农药备用。2、姜青枯菌的活化:从保藏好的姜青枯菌斜面上用接种环刮取一小环菌体,接种到装有50mLCPG液体培养基(配方:酸水解酪蛋1g,蛋白胨10g,葡萄糖5g,蒸馏水1000mL,自然pH,121℃灭菌15分钟)的250mL摇瓶中,30℃震荡培养12-16h,活化,所得姜青枯菌悬液即为活化后的姜青枯菌。3、抑菌实验A、取活化后的姜青枯菌培养液稀释100倍后,取100μL涂布于CPC固体培养基平板。并在平板上分别标记样品、阳性对照(25μg/L农用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种银杏内生球黑孢菌生物农药,其特征在于,包括银杏球黑孢菌发酵液、葡萄糖和玉米浆。/n

【技术特征摘要】
1.一种银杏内生球黑孢菌生物农药,其特征在于,包括银杏球黑孢菌发酵液、葡萄糖和玉米浆。


2.根据权利要求1所述银杏内生球黑孢菌生物农药,其特征在于,所述葡萄糖的终浓度为5-15g/L。


3.根据权利要求1所述银杏内生球黑孢菌生物农药,其特征在于,所述葡萄糖的终浓度为0.5-2g/L。


4.权利要求1所述银杏内生球黑孢菌生物农药的制备方法,其特征在于,按照如下步骤进行:
(1)银杏球黑孢菌的活化:取-80℃保藏的菌株,用接种环挑取孢子,在PDA斜面培养基上划线,在28℃恒温培养箱中培养5-7天,直至试管中长满菌丝;
(2)种子液的制备:用接种环取活化的菌丝,接种到装有100mLPDB液体培养基的500mL规格的摇瓶中,培养20-30h;
(3)发酵:采用发酵罐进行发酵,发酵培养基为PDB培养基,装液量为60%,发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员:沈玉平袁志辉齐成媚刘小文何福林张祖姣
申请(专利权)人:湖南科技学院
类型:发明
国别省市:湖南;43

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