经修饰的丝状真菌宿主细胞制造技术

本发明专利技术涉及产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT，以及在所述细胞中产生分泌的目的多肽的方法，连同产生所述细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的丝状真菌宿主细胞序列表的引用本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。
本专利技术涉及经修饰的丝状真菌细胞，以及用于产生此类细胞的方法，连同产生其中分泌的目的多肽的方法。
技术介绍
丝状真菌宿主细胞被广泛用于多种目的多肽的工业生产。大量的研究工作旨在改善丝状真菌宿主细胞中目的多肽的产生，特别是改善生产率和/或产率。
技术实现思路
本专利技术人发现，在产酶宿主细胞中修饰编码预测的推定的类固醇脱氢酶的基因可改善酶的生产率和/或产率。因此，在第一方面，本专利技术涉及产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。可以通过本领域已知的任何合适的方法来修饰、截短、灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或完全消除该天然推定的类固醇脱氢酶，例如，通过用异源启动子(优选地，受调控的启动子)替代所述基因的天然启动子来减少编码基因的表达。降低推定的类固醇脱氢酶水平的另一种策略可以是向蛋白质中添加去稳定化结构域，例如泛素结构域，从而降低蛋白质的半衰期。灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或完全消除该天然推定的类固醇脱氢酶的又另一种方式是共表达或添加一种或多种类固醇脱氢酶抑制剂。完全消除表达的便利方式的实例是基因缺失、基因替代或基因中断，例如通过在编码序列中引入无义突变。修饰编码序列的另一种方式可以是通过缺失一些编码序列或通过突变编码序列来干扰内含子加工而引入内部缺失。灭活推定的类固醇脱氢酶的又另一种方式可以是使用RNA干扰或siRNA或者通过插入含有启动子并且可能缺乏终止子的构建体来沉默其表达，该构建体的转录方向朝向编码推定的类固醇脱氢酶的基因的末端，导致编码推定的类固醇脱氢酶的基因的转录受到空间位阻(由于RNA聚合酶发生碰撞)或可能的mRNA去稳定化(由于形成具有互补序列的mRNA分子)。因此，在第二方面，本专利技术涉及产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，与非突变的亲本宿主细胞相比，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的目的多肽的改善的产率，所述方法包括无特定顺序的以下步骤：a)用编码分泌的目的多肽的多核苷酸构建体转化丝状真菌宿主细胞；以及b)突变宿主细胞以修饰、截短、部分或完全灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或消除该天然推定的类固醇脱氢酶，其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。本专利技术的最后一个方面涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在有利于产生该分泌的多肽的条件下培养如任一项前述权利要求所述的突变的丝状真菌宿主细胞；以及，任选地b)回收该分泌的目的多肽。附图说明图1示出了pNJOC577的质粒图。图2示出了pNJOC383的质粒图。图3示出了在SEQIDNO:3、6、9和12中鉴别的四种推定的类固醇脱氢酶的多重比对。相同的残基以黑色框表示。在四种蛋白质的三种中保守的残基以灰色框表示。使用MUSCLE算法版本3.8.31和默认参数来比对蛋白质(Edgar,R.C.(2004).NucleicAcidsResearch[核酸研究],32(5),1792-1797)。图4示出了pNJOC569的质粒图。图5示出了菌株NJOC587(对照)和NJOC618-81D(类固醇脱氢酶突变体)的相对溶菌酶生产率/产率(LSU(F)/ml)。将发酵结束时对照的LSU(F)/ml数据用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图6示出了pTmmD-Tl_脂肪酶的质粒图。图7示出了菌株NJOC600-2A(对照)和NJOC609-1A(类固醇脱氢酶突变体)的相对脂肪酶生产率/产率(LU(LXP)/ml)。将发酵结束时对照的LU(LXP)/ml数据用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图8示出了pSMai326的质粒图。图9示出了菌株NJOC608-1B(对照)和NJOC617-77C(类固醇脱氢酶突变体)的相对黄原胶酶生产率/产率。将发酵结束时对照的黄原胶酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图10示出了pTmmD-Mf_溶菌酶的质粒图。图11示出了菌株NJOC601-5A(对照)和NJOC610-2B(类固醇脱氢酶突变体)的相对M.f.溶菌酶生产率/产率(LSU(A)/ml)。将发酵结束时对照的溶菌酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图12示出了pIHAR473的质粒图。图13示出了pAT3631的质粒图。图14示出了菌株AT3091(对照)和AT3944(类固醇脱氢酶突变体)的相对植酸酶生产率/产率。将发酵结束时对照的植酸酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。定义cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本专利技术的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181128 US 62/772,3011.一种产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。


2.如权利要求1所述的宿主细胞，该宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属。


3.如权利要求1所述的宿主细胞，该宿主细胞是曲霉属细胞；优选地，棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉。


4.如权利要求1所述的宿主细胞，该宿主细胞是木霉属细胞；优选地，哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。


5.如权利要求1所述的宿主细胞，该宿主细胞是镰孢属细胞；优选地，杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、或镶片镰孢细胞。


6.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该分泌的目的多肽是天然的或异源的；优选地，该分泌的多肽是酶；更优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。


7.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该天然推定的类固醇脱氢酶包含与SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、和/或SEQIDNO:12所示的成熟氨基酸序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、和/或SEQIDNO:12所示的成熟氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。


8.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该天然推定的类固醇脱氢酶由如下基因编码，该基因包含与SEQIDNO:1、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、和/或SEQIDNO:10所示的基因组DNA序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与SEQIDNO:1、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、和/或SEQIDNO:10所示的基因组DNA序列具有至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。


9.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该天然推定的类固醇脱氢酶由如下基因编码，该基因包含与SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、和/或SEQIDNO:11所示的cDNA序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、和/或SEQIDNO:11所示的cDNA序列具有至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。


10.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该天然推定的类固醇脱氢酶通过编码基因的无义或移码突变，通过编码基因的部分或完全缺失，或通过编码基因的沉默被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除。


11.一种产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，与非突变的亲本宿主细胞相比，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的目的多肽的改善的产率，所述方法包括无特定顺...

【专利技术属性】
技术研发人员：M雷，N乔丘姆森，井上千穗，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK