用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法技术

本公开文本提供了一种使用离子交换色谱法通过以下方式纯化聚乙二醇化蛋白的新型方法：将具有高浓度的聚乙二醇化蛋白负载到离子交换色谱基质上并且收集所述聚乙二醇化蛋白，所述高浓度例如至少6克/升。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法相关申请的交叉引用本专利申请要求2018年11月5日提交的美国临时专利申请62/756,020的优先权，将其通过引用以其整体特此并入。
技术介绍
通过共价附接聚乙二醇分子(PEG)分子而对蛋白质或生物药物进行化学修饰可以赋予优于未经修饰的蛋白质或生物药物的若干个显著的优势，包括经修饰的蛋白质或生物药物的延长的半衰期、增强的水溶解度、降低的毒性、降低的肾清除率、和降低的免疫原性和抗原性。这些优势似乎主要是由于通过中性、化学惰性、亲水性PEG聚合物而显著增加的分子大小(流体动力学半径)以及表面改变和保护(“掩蔽”)。与聚乙二醇化蛋白的产生相关的挑战之一是，由聚乙二醇化过程产生异质产物，包括未反应的天然蛋白、未反应的PEG、和具有一系列聚乙二醇化位点和不同程度的缀合的聚乙二醇化物质。当聚乙二醇化产物用作治疗剂时，从不希望的残余杂质中纯化聚乙二醇化治疗分子是必需的。目前使用若干种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，诸如尺寸排阻色谱法(SEC)、疏水相互作用色谱法、和最常见的静电相互作用色谱法(离子交换色谱法，IEC)。然而，由于与PEG聚合物的性质相关的若干个因素，纯化聚乙二醇化蛋白是复杂的。PEG聚合物是中性的、亲水性的，并且它们在水溶液中的溶解度反而随温度降低。含有PEG和聚乙二醇化蛋白的聚乙二醇化反应产物混合物可以展现出起泡、粘度、和蛋白质或聚合物沉淀。由于聚乙二醇化产物是高分子量聚合物，因此它们倾向于非特异性地吸附到表面并且倾向于增加水溶液的粘度。这些特征强制性地使用于色谱纯化目的的负载溶液浓度降低至约1克/升以便适应色谱介质的能力，这导致低的产率和代价高昂的纯化方法。因此，需要开发一种用于纯化聚乙二醇化产物的快速并且经济的方法，所述方法导致更高产率的纯聚乙二醇化产物。
技术实现思路
本公开文本提供了一种使用离子交换色谱法纯化聚乙二醇化产物的有效方法。出人意料地，发现与实践的色谱原理相矛盾，增加负载到分离基质上的聚乙二醇化蛋白浓度导致离子交换基质的结合能力出乎意料地增加和/或聚乙二醇化产物的纯化产率改善。本公开文本的方法提供了时间和成本节约两者：(1)通过增加负载的蛋白质的浓度，减少纯化循环的次数，并且(2)观察到的基质的较高结合能力降低了频繁清洁和更换色谱基质的必要性。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，所述方法包括将具有至少6克/升的高浓度的聚乙二醇化蛋白负载到离子交换色谱基质上，并且收集所述聚乙二醇化蛋白。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中与以1g/L的浓度负载的收集的聚乙二醇化蛋白的产率相比，所述具有高浓度的聚乙二醇化蛋白的负载导致所收集的聚乙二醇化蛋白的产率增加。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中所收集的聚乙二醇化蛋白的产率增加至少约1.5倍、至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、或约40倍。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中与当聚乙二醇化蛋白以1g/L的浓度负载时所述离子交换基质的负载能力相比，所述具有高浓度的聚乙二醇化蛋白的负载导致所述离子交换基质的负载能力增加。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中所述离子交换基质的负载能力从6g增加至约7g、约8g、约9g、约10g、约11g、约12g、约13g、约14g、约15g、约16g、约17g、约18g、约19g、或约20g聚乙二醇化蛋白/L基质。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中与当聚乙二醇化蛋白以1g/L的浓度负载时所述离子交换基质的结合能力相比，所述具有高浓度的聚乙二醇化蛋白的负载导致离子交换基质的结合能力增加。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中与当聚乙二醇化蛋白以1g/L的浓度负载时离子交换基质的负载能力相比，所述离子交换基质的结合能力增加约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、或约30倍。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中所述离子交换色谱基质的结合能力是至少7g、至少7.5g、至少8g、至少8.5g、至少9g、至少9.5g、至少10g、至少10.5g、至少11g、至少11.5g、至少12g、至少12.5g、至少13g、至少13.5g、至少14g、至少14.5g、至少15g、至少15.5g、至少16g、至少16.5g、或至少17g聚乙二醇化蛋白/L基质。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中所收集的聚乙二醇化蛋白是至少约20％纯、至少约25％纯、至少约30％纯、至少约35％纯、至少约40％纯、至少约45％纯、至少约50％纯、至少约55％纯、至少约60％纯、至少约65％纯、至少约70％纯、至少约75％纯、至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、或至少约98％纯。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中在离子交换色谱法期间的UV干扰降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少98％。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中在所述负载前将所负载的聚乙二醇化蛋白在无催化剂的情况下浓缩。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中在所述负载前将所负载的聚乙二醇化蛋白通过切向流过滤浓缩。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中以高浓度负载的聚乙二醇化蛋白具有至少约7g/L、至少约8g/L、至少约9g/L、至少约10g/L、至少约11g/L、至少约12g/L、至少约13g/L、至少约14g/L、至少约15g/L、至少约20g/L、至少约25g/L、至少约30g/L、至少约35g/L、至少约40g/L、至少约45g/L、至少约50g/L、至少约55g/L、或至少约60g/L的浓度。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中以高浓度负载的聚乙二醇化蛋白具有约10g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L、约40g/L、约45g/L、约50、约55、或约60g/L的浓度。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，其中所述以高浓度负载的聚乙二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，所述方法包括将具有至少6克/升的高浓度的聚乙二醇化蛋白负载到离子交换色谱基质上，并且收集所述聚乙二醇化蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181105 US 62/756,0201.一种用于纯化聚乙二醇化蛋白的方法，所述方法包括将具有至少6克/升的高浓度的聚乙二醇化蛋白负载到离子交换色谱基质上，并且收集所述聚乙二醇化蛋白。


2.根据权利要求1所述的方法，其中与以1g/L的浓度负载的收集的聚乙二醇化蛋白的产率相比，所述具有高浓度的聚乙二醇化蛋白的负载导致所收集的聚乙二醇化蛋白的产率增加。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述收集的聚乙二醇化蛋白的产率增加至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、或约40倍。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与当聚乙二醇化蛋白以1g/L的浓度负载时所述离子交换基质的负载能力相比，所述具有高浓度的聚乙二醇化蛋白的负载导致所述离子交换色谱基质的负载能力增加。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述离子交换基质的负载能力从6增加至7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20g聚乙二醇化蛋白/L基质。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与当聚乙二醇化蛋白以1g/L的浓度负载时所述离子交换色谱基质的结合能力相比，所述具有高浓度的聚乙二醇化蛋白的负载导致离子交换色谱基质的结合能力增加。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述离子交换基质的结合能力增加约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、或约30倍。


8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述离子交换色谱基质的结合能力是至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10、至少10.5、至少11、至少11.5、至少12、至少12.5、至少13、至少13.5、至少14、至少14.5、至少15、至少15.5、至少16、至少16.5、或至少17g聚乙二醇化蛋白//L基质。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所收集的聚乙二醇化蛋白是至少约20％纯、至少约25％纯、至少约30％纯、至少约35％纯、至少约40％纯、至少约45％纯、至少约50％纯、至少约55％纯、至少约60％纯、至少约65％纯、至少约70％纯、至少约75％纯、至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在离子交换色谱法期间的UV干扰降低至少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少98％。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在所述负载前将所负载的聚乙二醇化蛋白在无催化剂的情况下浓缩。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在所述负载前将所负载的聚乙二醇化蛋白通过切向流过滤浓缩。


13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中所述以高浓度负载的聚乙二醇化蛋白具有至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60g/L的浓度。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述以高浓度负载的聚乙二醇化蛋白具有约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60g/L的浓度。


15.根据权利要求14所述的方法，其中所述以高浓度负载的聚乙二醇化蛋白具有约30g/L的浓度。


16.根据权利要求13所述的方法，其中所收集的聚乙二醇化蛋白的产率是至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％。


17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使用洗涤缓冲液洗涤所述基质。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使用洗脱缓冲液洗脱所述聚乙二醇化蛋白。


19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述离子交换色谱法是阳离子交换色谱法。


20.根据权利要求19所述的方法，其中所述离子交换色谱法包括CEX树脂，所述CEX树脂选自PorosHS、PorosXS、羧甲基纤维素、BAKERBONDABXTM、固定在琼脂糖上的磺丙基和固定在琼脂糖上的磺酰基、MonoS、MiniS、Source15S、30S、SPSEPHAROSETM、CMSEPHAROSETM、BAKERBONDCarboxy-Sulfon、WPCBX、WP磺酸、HydrocellCM、HydrocelSP、UNOsphereS、Macro-PrepHighS、Macro-PrepCM、陶瓷HyperDS、陶瓷HyperDCM、陶瓷HyperDZ、TrisacrylMCM、TrisacrylLSCM、TrisacrylMSP、Trisacr...

【专利技术属性】
技术研发人员：于德强，J·约翰帕，H·费罗兹，宋远礼，S·高斯，李正剑，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：美国;US