【技术实现步骤摘要】
一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母及其构建方法
本专利技术属于生物工程
，涉及工业微生物的基因重组，特别是一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株及其构建方法。技术背景酵母发酵生产过程中会产生大量的有机酸，使发酵体系的酸度升高，pH值降低。由于酿酒酵母耐酸性能的限制，发酵醪液中酸度的提高会导致酵母的发酵性能降低，影响到生产。对于一些发酵食品(酒类、面包、酱油和食醋等)来说，有机酸也是重要的呈味物质和风味前驱物质，对食品风味品质的提高不可或缺。在酵母发酵生产过程中，由于作为发酵副产物的多种有机酸的不断生成，使发酵醪液的pH值不断下降，酸度不断提高。但酸度的升高会对生产造成危害，包括：①抑制生醇发酵中乙醇的生成，造成减产；②使酵母等有益菌被抑制，生长和发酵活力下降；③使发酵代谢相关酶的活性受到影响，并造成原料的消耗增加，生产效率降低；④产物的产出水平下降，产品得率降低，甚至造成发酵的停滞和提前终止；⑤对于边糖化边发酵的“双边发酵”生产来说，酸度升高时，酵母菌的发酵活力减弱，但糖化作用相对增强，造成醪液中糖分的...
【技术保护点】
1.一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母含有一个改造后的编码PrA的等位基因PEP4’，其序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母含有一个改造后的编码PrA的等位基因PEP4’，其序列如序列表中SEQIDNO：2所示。
2.根据权利要求1所述的一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括在对起始酿酒酵母一个编码PrA的等位基因PEP4进行敲除的基础上，对另一个编码PrA的等位基因PEP4的特定部位进行序列改造；所述敲除的等位基因PEP4的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示；所述改造后的等位基因PEP4’的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。
3.根据权利要求2所述的一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述起始酿酒酵母为黄酒酵母。
4.根据权利要求2所述的一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下构建步骤：
(1)以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增PrA编码序列PEP4特定的上游区段DNA片段“U-PO”和下游区段DNA片段“D-PO”，并将两个DNA片段进行连接得到DNA片段“PO”。
(2)将DNA片段“PO”连接到载体pMD19后，“PO”序列的上游和下游之间插入DNA片段“Kan”，替换部分原始PrA编码ORF序列得到重组质粒，以重组质粒为模板，通过PCR扩增得到重组DNA片段，以重组DNA片段转化一个蛋白酶A编码序列等位基因敲除的菌株，得到具有一个PrA等位基因PEP4敲除和另一个PrA等位基因编码序列经过改造为PEP4’的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下构建步骤：
(1)重组质粒的构建
①以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到PEP4基因编码ORF序列上游区段“U-PO”；以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到PEP4基因编码ORF序列下游区段“D-PO”。然后将DNA片段“U-PO”和“D-PO”进行连接，得到DNA片段“PO”，并在连接产物中引入2个酶切位点；
②将DNA片段“PO”克隆到载体pMD19中，得到重组质粒。以质粒pUG6为模板，通过PCR扩增得到DNA片段“Kan”，并将得到的DNA片段定向插入到步骤(1)中得到的质粒的“PO”区段引入的克隆位点，得到重组质粒；
(2)PrA编码序列第二个等位基因的序列改造
①以步骤(1)中构建的重组质粒为模板，通过PCR扩增得到对PrA编码部分ORF序列中间区段使用进行了替换的重组DNA片段“REC-PO”；
②使用电击转化法，以重组DNA片段“REC-P...
【专利技术属性】
技术研发人员：张洪波，从剑杭，黄燕，陈敏芳，何汶霞，李燕婷，何欣煜，陆佳燕，
申请(专利权)人：绍兴文理学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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