一种多糖的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多糖的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：(1)将植物酵素样品依次经过淀粉酶酶解、蛋白酶酶解、核酸酶酶解和醇沉后得到多糖提取液；(2)配制系列标准品溶液，进行高效体积排阻色谱分析，构建相对分子质量校正曲线，并根据各标准品溶液的浓度及其峰面积计算得到标准品溶液的峰面积响应因子；(3)将步骤(1)的多糖提取液采用高效体积排阻色谱进行检测，根据所述多糖提取液的特征峰面积和步骤(2)得到的标准品溶液的峰面积响应因子计算多糖含量。本发明专利技术通过酶解去除测试样品中淀粉质和糊精类非特征性多糖以及蛋白类和核酸类生物大分子物质的干扰，再通过高效体积排阻色谱法分离检测特征性多糖含量，测试结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种多糖的检测方法
本专利技术属于检测
，具体涉及一种多糖的检测方法。
技术介绍
多糖是食用植物酵素中规定的一个重要特征性质量指标，其多糖不包括淀粉质及糊精类。现有植物酵素行业标准QB/T5323-2018关于多糖含量的测定方法，引用出入境检验检疫行业标准“SN/T4260-2015出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚硫酸法”。现有的SN/T4260-2015中测定多糖的方法，主要适用于食用菌、枣类、果汁等植物源食品中粗多糖含量的测定，其方法是将样品粉碎后利用80％乙醇在超声振荡条件下提取，除去小分子物质，再将不溶物质用水超声提取两次。再对水提取物用苯酚硫酸法测定多糖含量。苯酚硫酸法原理是用浓硫酸将多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。但现有技术的样品处理方法不能排除淀粉质及糊精类多糖物质的干扰。而且苯酚硫酸法测定多糖含量首先需用系列不同浓度的葡萄糖标液制作吸光度-葡萄糖浓度标准曲线，据此标曲方程及样品的吸光度计算样品中多糖含量。因多糖大多是杂多糖，即一般由多种单糖组成，其中不同的单糖成分对于苯酚-硫酸法的响应值不同，故用单一葡萄糖的标准曲线计得的杂多糖含量结果偏差必然较大。
技术实现思路
针对上述现有技术的缺点，本专利技术提供一种多糖的检测方法。本专利技术所述多糖的检测方法可以避免淀粉质、糊精类物质、蛋白质和核酸类大分子物质的干扰，较准确地检测多糖含量，且检测结果可靠，重复性和稳定性好。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种多糖的检测方法，包括如下步骤：(1)将植物酵素样品依次经过淀粉酶酶解、蛋白酶酶解、核酸酶酶解和醇沉后得到多糖提取液；(2)配制系列标准品溶液，进行高效体积排阻色谱分析，构建相对分子质量校正曲线，并根据各标准品溶液的浓度及其峰面积计算得到标准品溶液的峰面积响应因子；(3)将步骤(1)的多糖提取液采用高效体积排阻色谱进行检测，根据所述多糖提取液的特征峰面积和步骤(2)得到的标准品溶液的峰面积响应因子，计算所述植物酵素样品中多糖的含量。本专利技术利用淀粉酶酶解的方法使植物酵素的淀粉质及糊精类物质完全水解为小分子葡萄糖，避免淀粉质及糊精类物质对特征性多糖含量测定的影响；同时，利用蛋白酶和核酸酶对测试样品进行进一步酶解处理，可以避免后续利用高效体积排阻色谱法测定时，可能存在的蛋白质和核酸类大分子物质的干扰；最后采用醇沉方法将多糖分离，经水溶得到多糖提取液，然后使用高效体积排阻色谱法分离测定，以示差折光检测器检测多糖含量，检测结果可靠，重复性和稳定性好。作为本专利技术的优选实施方式，所述步骤(3)中，多糖提取液的特征峰面积为相对分子质量为3000以上的所有峰的总面积。本专利技术经过科学理论检索和探索，超过20个单糖的聚合物称为多糖。若按20个单糖聚合的多糖计，假设其中六碳糖和五碳糖各占一半，则多糖的相对分子质量为2958，即近似为3000，因此，本专利技术限定相对分子质量为3000以上的所有峰为多糖的特征峰。作为本专利技术的优选实施方式，所述步骤(2)中，系列标准品溶液为至少6个不同相对分子质量大小的右旋糖酐标准品溶液，所述右旋糖酐标准品溶液的浓度为5mg/mL；所述右旋糖酐标准品的相对分子质量选自2700-2000000。更优选地，所述步骤(2)中，系列标准品溶液中的标准品分别为相对分子质量为2700，9750，13050，64650，135350，300600的右旋糖酐标准品。作为本专利技术的优选实施方式，所述步骤(2)中，标准品溶液的峰面积响应因子为所有标准品溶液的单位浓度峰面积平均值或与步骤(1)的多糖提取液中峰面积最大的级分的峰值相对分子质量最相近的标准品溶液的单位浓度峰面积。步骤(1)的多糖提取液中峰面积最大的级分的峰值相对分子质量是指该多糖级分内的最大峰高处(即纵坐标值最大处)所对应的相对分子质量(即MP)。所述测试样品中多糖含量计算公式为：Xi＝At×V1×100/(Au×V2×M)其中，Xi为植物酵素中多糖含量，多糖含量的单位为mg/100g；At为测试样品中相对分子质量为3000以上的所有峰的总面积；Au为标准品溶液的峰面积响应因子；M为测试样品的质量(g)；V1为所述多糖检测方法步骤(1)具体方法中的步骤S2中蛋白酶酶解反应完并杀酶和冷却后加水定容后溶液B的体积(mL)；V2是所述多糖检测方法步骤(1)具体方法中的步骤S3中用于核酸酶酶解的溶液B的体积(mL)。作为本专利技术的优选实施方式，所述步骤(2)中，对标准品溶液进行高效体积排阻色谱进样分析，根据系列标准品溶液的相对分子质量的对数和保留时间，构建相对分子质量校正曲线。作为本专利技术的优选实施方式，所述相对分子质量校正曲线为相对分子质量的对数对保留时间作线性回归的曲线。当系列标准品溶液中的右旋糖酐标准品的相对分子质量分别为2700，9750，13050，64650，135350，300600时，保留时间(min)分别为22.601，21.037，20.754，19.283，18.447，17.926，则所述相对分子质量校正曲线的方程为：LogM＝-0.4368T+13.233其中，M为相对分子质量；T为保留时间。作为本专利技术的优选实施方式，所述标准品溶液中的标准品的浓度为已知浓度。作为本专利技术的优选实施方式，所述高效体积排阻色谱的色谱条件为流速：0.7-1.0mL/min；柱温：30-45℃；进样量：10-20μL；流动相：浓度为0.1mol/L的硝酸钠溶液或浓度为0.1mol/L的醋酸钠溶液。所述硝酸钠溶液为硝酸钠水溶液；所述醋酸钠溶液为醋酸钠水溶液。作为本专利技术的优选实施方式，所述高效体积排阻色谱使用的色谱柱为UltrahydrogelTMLinear300mm×7.8mmi.d.的2根柱串联，或ShodexOHpakSB-803HQ、SB-804HQ和SB-805HQ的3根柱串联，所述3根柱的长度和内径均为300mm×8.0mmi.d.。作为本专利技术的优选实施方式，所述步骤(1)具体为：S1：称取9-11克的液体植物酵素样品或2.0-3.0克的固体饮料剂型的植物酵素样品，用浓度为0.01-0.02mol/L的pH＝5.5-6.0磷酸盐缓冲液溶解定容至25mL，然后加入10-20μL复合淀粉糖化酶，于60℃振荡酶解反应2-4小时后，置入95℃杀酶3-5min，冷却至58℃，然后用2mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.0-8.5，得到溶液A；S2：将溶液A中加入10-15mg碱性蛋白酶于58℃下振荡反应2-3小时后，置入95℃下杀酶3-5min，冷却至室温后，离心取上清液，然后加水定容后为溶液B；S3：取5mL溶液B与25μL全能核酸酶稀释液混合，在37℃下反应15min后，于95℃下杀酶3-5min，冷却至室温后，离心取上清液为溶液C；S4：将4倍溶液C体积的无水乙醇和溶液C混合，在4℃下静置8-12h后，离心取沉淀物加水溶解并定容至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多糖的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将植物酵素样品依次经过淀粉酶酶解、蛋白酶酶解、核酸酶酶解和醇沉后得到多糖提取液；/n(2)配制系列标准品溶液，进行高效体积排阻色谱分析，构建相对分子质量校正曲线，并根据各标准品溶液的浓度及其峰面积计算得到标准品溶液的峰面积响应因子；/n(3)将步骤(1)的多糖提取液采用高效体积排阻色谱进行检测，根据所述多糖提取液的特征峰面积和步骤(2)得到的标准品溶液的峰面积响应因子计算所述植物酵素样品中多糖的含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种多糖的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将植物酵素样品依次经过淀粉酶酶解、蛋白酶酶解、核酸酶酶解和醇沉后得到多糖提取液；
(2)配制系列标准品溶液，进行高效体积排阻色谱分析，构建相对分子质量校正曲线，并根据各标准品溶液的浓度及其峰面积计算得到标准品溶液的峰面积响应因子；
(3)将步骤(1)的多糖提取液采用高效体积排阻色谱进行检测，根据所述多糖提取液的特征峰面积和步骤(2)得到的标准品溶液的峰面积响应因子计算所述植物酵素样品中多糖的含量。


2.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，多糖提取液的特征峰面积为相对分子质量为3000以上所有峰的总面积。


3.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，系列标准品溶液为至少6个不同相对分子质量大小的右旋糖酐标准品溶液，所述右旋糖酐标准品溶液的浓度为5mg/mL；所述右旋糖酐标准品的相对分子质量选自2700-2000000。


4.如权利要求3所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述右旋糖酐标准品包括相对分子质量为2700的右旋糖酐标准品和至少一个相对分子质量大于所述步骤(1)中多糖提取液的相对分子质量分布范围上限的右旋糖酐标准品。


5.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，标准品溶液的峰面积响应因子为所有标准品溶液的单位浓度峰面积平均值或与步骤(1)的多糖提取液中峰面积最大的级分的峰值相对分子质量最相近的标准品溶液的单位浓度峰面积。


6.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对标准品溶液进行高效体积排阻色谱进样分析，根据系列标准品溶液的相对分子质量的对数和保留时间，构建相对分子质量校正曲线。


7.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述高效体积排阻色谱的色谱条件为：流速：0.7-1.0mL/min；柱温：30-45℃；进样...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖晧，戴军，曹小彦，王海鸣，徐洪文，
申请(专利权)人：广州广电计量检测股份有限公司，广州广电计量检测无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44