免疫磁珠富集后的细菌待检测样品的磁珠去除方法技术

本发明专利技术提供了一种对免疫磁珠富集后的细菌待检测样品的磁珠去除方法，用蛋白酶将抗体的Fc端与抗体切割分离，使得抗体Fc端连接的磁珠与细菌菌体分离开来。本发明专利技术首次发现抗体本身的Fc端是一个新的菌体和磁珠的分离位点，而且提供了优化的菌体和磁珠的分离条件。本方法能够有效切断细菌菌体和磁珠之间的连接，不对细菌产生损伤，且纯化得到的细菌菌液中残存的磁珠数量不影响后续细菌检测的准确度。

【技术实现步骤摘要】
免疫磁珠富集后的细菌待检测样品的磁珠去除方法
：本专利技术属于微生物检测领域，涉及一种细菌检测的前处理方法，具体涉及对经过免疫磁珠捕获的细菌进行纯化去除磁珠的方法。
技术介绍
：免疫磁珠是对具有超顺磁性的微粒表面进行化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合的磁珠。抗体耦连在磁珠上，用于捕获细菌并且磁分离。很多快速的细菌检测方法，例如流式分析技术检测法、荧光定量PCR检测方法，胶体金免疫层析检测方法等，虽然检测速度快，但是检测的灵敏度不够，还容易受到检测样品中复杂的其它物质的干扰。因此，这些方法往往需要结合免疫磁珠富集技术，即将目标细菌从食品基质中捕获并磁分离，从而得到富集的细菌，便于后续检测。然而经过磁分离步骤后，免疫磁珠捕获得到的细菌表面往往会连接有大量的磁珠，这些磁珠会对上述快速检测技术产生干扰，影响检测结果的准确性。比如，流式分析检测方法极易把两个或多个黏连的细菌当做一个细菌去识别，造成检测数据的不准确。比如，在荧光定量PCR检测方法和胶体金免疫层析检测方法中，磁珠大量包裹细菌，从而降低核酸提取效率，检测数据不准确的同时增加检测时间。因此，在进行细菌的检测前，将免疫磁珠捕获的细菌去除磁珠，进行纯化很有必要。即，将经过磁分离得到细菌与其表面连接的免疫磁珠有效分开，将大大提高上述快速检测方法的准确性。开发一种细菌和免疫磁珠分离的技术，是当前免疫磁珠结合快速检测技术检测细菌这类方法的实际需要，也是新思路和技术难点。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种对免疫磁珠富集后的细菌待检测样品的磁珠去除方法，尤其是要满足以下要求：1、能够切断细菌菌体和磁珠之间的连接；2、不能对细菌产生损伤；3、纯化得到的细菌菌液中残存的磁珠数量不影响后续细菌检测的准确度；要达到上述专利技术目的，具有两个技术关键点：一是找到合适的切割细菌和磁珠连接的位点，二是找到优化的菌体和磁珠的分离条件。为解决上述关键技术问题，本专利技术人进行了如下探索，克服了以下技术难点：1、切割位点的选择，本专利技术发现已知的两个切割位点都不适于本专利技术目的。本专利技术首次发现，抗体本身的Fc端是一个新的有效切割位点，且蛋白酶可以作为切断细菌和磁珠连接的材料。细菌和磁珠的连接中目前已知存在两个切割位点：抗原抗体之间的连接和磁珠和抗体之间的连接。(1)细菌和磁珠通过抗原抗体反应进行连接，磁珠表面耦连有大量抗体，可以和细菌特异性结合。抗原抗体之间的亲和力高，亲和力KD通常能达到10-10；特异性好，抗原是O抗原(菌体抗原)，抗体是针对整个菌体的单克隆抗体，大量的磁珠通过抗体连接在菌体表面，甚至覆盖住了菌体(见实施例1)。(2)磁珠和抗体之间通过羧基氨基反应进行连接。磁珠表面的羧基和抗体表面的氨基经过EDC/NHS的催化，进行缩合反应，反应进行程度高。本专利技术进行实验评估，发现这两个切割位点都不适于达到本专利技术目的：磁珠和抗体之间的羧基氨基反应难以进行切割，而抗原抗体之间的反应虽然可以通过强酸、强碱、高盐的环境进行逆转，但上述极端环境会严重损伤细菌的活性(见实施例2)。排除了上述两个切割位点后，需要寻找潜在的新的切割位点。本专利技术经过大量的研究，发现将抗体本身进行切割是一个可行的思路。抗体的结构为Y形状，分为2个Fab端和1个Fc端，本专利技术人发现，使用蛋白酶，可以将抗体的Fc端切割分离开。用蛋白酶进行抗体切割，通常应用于抗体片段化等领域。尚未有任何研究提出将蛋白酶用于抗原和抗体Fc端及Fc端连接物的分离。经多种分析技术验证，使用蛋白酶将抗体Fc端与抗体切割分离，对于切割细菌磁珠连接是有效的。2、筛选抗体切割所用的蛋白酶的选择本专利技术对多个蛋白酶进行了大量实验验证，发现能用于本专利技术的蛋白酶应该符合以下技术指标：a)是能够实现抗体的片段化的内肽酶；b)不会对细菌产生损伤；c)使用该蛋白酶对免疫磁珠的细菌进行纯化，纯化效率大于89％；c)可以在2.5个小时内实现细菌和磁珠的分离。本专利技术对多个蛋白酶进行了大量验证筛选，发现达到上述要求的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶等。其中最优选的蛋白酶是木瓜蛋白酶(见实施例4)，该酶切割效率高，速度快，不对细菌产生损伤。3、建立了一种用于细菌免疫磁珠富集后的纯化方法，其特征是包括如下步骤：1)在免疫磁珠捕获的细菌样品溶液中加入蛋白酶蛋白酶可以切断免疫磁珠上细菌抗体的Fab端和Fc端之间的连接，使得Fab端连接的细菌菌体和Fc端连接的磁珠分离开来。2)在上述样品溶液旁放置磁铁磁铁可以使分离下来的磁珠吸附于靠近磁铁的样品容器壁。可以使用一种能固定磁铁的磁力架进行。3)将分离出磁珠的样品溶液转移至另外容器，得到纯化的细菌样品。所述蛋白酶的工作条件是：a)工作浓度在0.01％至0.1％(质量分数)之间；b)最适反应温度是37℃。经过免疫磁珠捕获的细菌进行纯化(分离免疫磁珠)后的细菌样品，可以用各种细菌快速精确检测方法进行细菌的定量检测。因此，本方法是一种细菌检测的前处理步骤。所述细菌快速精确检测方法，包括流式分析技术、荧光定量PCR检测方法，胶体金免疫层析技术等。所述纯化效率，其测定方法为：免疫磁珠对细菌菌液进行捕获，使用流式分析技术测定上清液的细菌浓度；然后使用蛋白酶对磁珠捕获的细菌进行纯化，磁分离后使用流式分析技术检测纯化后的细菌浓度；然后用如下公式计算纯化效率：式中，α为蛋白酶纯化免疫磁珠捕获的细菌的纯化效率；A为菌液的初始浓度，CFU/mL；B为免疫磁珠捕获后，上清液中的细菌浓度，CFU/mL；C为纯化后的细菌浓度，CFU/mL。本专利技术以检测大肠杆菌O157：H7为例，对经过免疫磁珠捕获的大肠杆菌O157：H7进行了纯化实验，证实了本专利技术的效果。详见实施例。其中：实施例1是免疫磁珠富集后的大肠杆菌O157：H7菌体，菌体被磁珠包裹。实施例2证明了其它免疫磁珠捕获的大肠杆菌O157：H7的纯化方法(如强酸、强碱、高盐)会严重损伤细菌的活性。实施例3是一次使用蛋白酶进行纯化的具体操作。实施例4使用流式分析技术对多种蛋白酶切割效果进行筛选。实施例5Protease-4蛋白酶对捕获菌体磁珠进行酶切后表征验证。实施例6纯化方法中，Protease-4蛋白酶用量，反应时间，温度的优化。实施例7-9验证了本专利建立的细菌样品纯化的前处理方法，可以应用于流式分析检测、荧光定量PCR检测、胶体金免疫层析的检测方法。本专利技术虽然仅用大肠杆菌O157：H7为例进行验证，但可以推测其它细菌的检测中，也可用本专利技术方法。因为大量前人的实验表明，所用蛋白酶适用于抗体片段化，可以将任何抗体的Fab端与Fc端酶解分离。本专利技术具有以下创新和优点：1、本专利技术首次发现，抗体本身的Fc端是一个新的有效切割位点；...

【技术保护点】
1.一种对免疫磁珠富集后的细菌待检测样品的磁珠去除方法，其特征是对偶连有磁珠的抗体本身进行切割。/n

【技术特征摘要】
1.一种对免疫磁珠富集后的细菌待检测样品的磁珠去除方法，其特征是对偶连有磁珠的抗体本身进行切割。


2.权利要求1所述的方法，所述切割的位点是抗体Fc端。


3.权利要求1所述的方法，所述切割，是用蛋白酶酶解的方式将抗原和抗体Fc端及其连接的磁珠进行分离。


4.权利要求3所述的方法，所述蛋白酶应该符合以下技术指标：
a)是能够实现抗体的片段化的内肽酶；
b)不会对细菌产生损伤；
c)使用该蛋白酶对免疫磁珠的细菌进行纯化，纯化效率大于89％；
d)可以在2.5个小时内实现细菌和磁珠的分离；
其中，c)中所述的纯化效率的测定方法为：免疫磁珠对细菌菌液进行捕获，使用流式分析技术测定上清液的细菌浓度；然后使用蛋白酶对磁珠捕获的细菌进行纯化，磁分离后使用流式分析技术检测纯化后的细菌浓度；然后用如下公式计算纯化效率：



式中，
α为蛋白酶纯化免疫磁珠捕获的细菌的纯化效率；
A为菌液的初始浓度，CFU/mL；
B为免疫磁珠捕获后，上清液中的细菌浓度，CFU/mL；...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋志伟，刘思渊，王梓权，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11