环状RNA circ-26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了环状RNA circ‑26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术通过构建大鼠脊髓损伤半切模型，取损伤不同时间点的脊髓组织，通过RNA‑seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circRNAs。针对筛选到的circRNAs设计特异性的背向引物，再通过PCR验证以及测序鉴定，得知环状RNA circ‑26782在脊髓损伤后表达持续下降。因此，可以通过下调或者抑制机体circ‑26782的表达，促进神经元轴突再生，进而有利于中枢神经损伤修复。

【技术实现步骤摘要】
环状RNAcirc-26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及环状RNAcirc-26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用。
技术介绍
中枢神经损伤修复是长期以来尚未解决的医学难题，损伤后如何提高神经元的再生能力促进轴突再生一直是神经再生研究领域中最受关注的热点。脊髓损伤后机体会发生一系列细胞和分子水平上的变化，涉及多种细胞，包括神经元细胞、星形胶质细胞、少突细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞等，影响轴突损伤后的再生微环境。当神经损伤轴突断裂后，轴突顺行、逆行运输中断，远端轴突溃变，近端轴突回缩。但轴突可以通过再生的方法，与靶细胞可以形成功能性的突触，这也是脊髓损伤后运动和神经功能恢复的基础和目标。一般来说，脊髓损伤后，损伤轴突再生或/和芽生并不少见，但由于胶质瘢痕的形成、轴突生长抑制因子的存在、神经营养因子分泌的不足以及神经元内在生长状态等因素的影响，神经损伤后轴突再生比较困难。因此，促进脊髓损伤后轴突再生是治疗脊髓损伤首要解决的问题。环状RNA（CircularRNAs，circRNAs）是一类新的具有闭合环状结构的内源性非编码RNA，与线性RNAs（信使RNAs[mRNAs]）、microRNAs（miRNAs）相比，circRNAs不具有5’帽状和3’尾状结构，而其共价闭环结构则是通过反向剪接产生的。越来越多的研究支持circRNAs通过充当miRNA海绵，与RNA结合蛋白相互作用，调节转录，从而影响了包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病等多种疾病的发生发展。目前关于circRNAs的研究主要集中在癌症方面，其在中枢神经系统损伤修复中的作用鲜有报道，尤其是在神经轴突再生调节方面。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供环状RNAcirc-26782在制备脊髓损伤诊断试剂或治疗药物中的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：环状RNAcirc-26782在制备脊髓损伤诊断试剂中的应用，所述环状RNAcirc-26782的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，首尾连接成环状结构。进一步地，所述脊髓损伤为中枢神经系统脊髓损伤。进一步地，所述诊断试剂还包括检测所述环状RNAcirc-26782的引物对，该引物对序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。环状RNAcirc-26782在筛选脊髓损伤治疗药物中的应用。进一步地，所述脊髓损伤为中枢神经系统脊髓损伤。环状RNAcirc-26782抑制剂在制备脊髓损伤治疗药物中的应用。进一步地，所述脊髓损伤为中枢神经系统脊髓损伤。进一步地，所述环状RNAcirc-26782抑制剂为小分子化合物、蛋白、多肽、多糖、糖蛋白、糖肽或核酸中的一种或几种。进一步地，所述核酸为siRNA，该siRNA的序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。本专利技术通过构建大鼠脊髓损伤半切模型，取损伤不同时间点的脊髓组织，通过RNA-seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circRNAs。针对筛选到的circRNAs设计特异性的背向引物，再通过PCR验证以及测序鉴定，得知环状RNAcirc-26782在脊髓损伤后表达持续下降。另外，在原代培养的E14脊髓神经元中，设计siRNA干扰circ-26782的表达，可以明显促进神经元轴突的生长。附图说明图1为实施例1中circ-26782在大鼠脊髓损伤后脊髓组织中不同时间点的表达变化（以GAPDH为内参）。图2为实施例2中circ-26782的siRNA对原代培养E14脊髓神经元中circ-26782表达的影响（以GAPDH为内参）。图3为实施例2中circ-26782的siRNA干扰circ-26782对E14脊髓神经元轴突的影响。具体实施方式本专利技术构建大鼠脊髓损伤半切模型，取损伤不同时间点的脊髓组织，通过RNA-seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circRNAs。针对筛选到的circRNAs设计特异性的背向引物，再通过PCR验证以及测序鉴定，获得一种新的环状RNAcirc-26782。在原代培养的E14脊髓神经元中，设计siRNA干扰circ-26782的表达，可以明显促进神经元轴突的生长。以下通过实施例说明本专利技术的具体步骤，但不受实施例限制。在本专利技术中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1circ-26782的表达与鉴定对SD（SpragueDawley）大鼠脊髓半切损伤后不同时间点（0d、1d、3d、7d、14d、21d和28d）的脊髓组织进行RNA-seq。根据测序结果挑选全部由外显子组成且环>500nt的表达差异明显的circRNAs。测序结果分析筛选出来的circRNA，进一步通过PCR验证circRNA的存在。根据circRNAs引物设计原则对这些circRNAs设计背向引物，每个circRNA使用NCBI设计引物。根据引物信息选择不同的退火温度进行PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳选出条带大小与预期相符的circRNAs，送公司测序，并将测序结果与原始序列比对验证其是否跨越环化位点。最终得到与预期条带大小一致且测序鉴定过环化位点的circRNAs，并挑选其中的circ-26782进行进一步研究，circ-26782的cDNA序列如SEQIDNO:1所示。一、脊髓组织RNA提取取鼠脊髓T9半切损伤后不同时间点（0d、1d、3d、7d、14d、21d和28d）的损伤处近端5mm脊髓组织按TRIZOL®Reagent（Thermofisher）说明书提取组织RNA。大鼠脊髓损伤后不同时间点的损伤组织放入1.5mLRNase-freeEP管，加入1mLTRIZOL®Reagent（Thermofisher）；将EP管置于冰中并使用电动匀浆器将组织匀浆，冰上裂解5min。加入三氯甲烷200µL，涡旋剧烈振荡20s，室温静置5min；13000rpm，4℃离心15min。小心仔细吸取上清，加入异丙醇500µL，上下颠倒轻柔混匀，室温静置10min，13000rpm，4℃离心15min，弃除上清。加入1mL75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心13000rpm，5min；去除上清，吹干。加入适量RNase-freeH2O，65℃促溶10min；检测RNA的OD值及浓度，-80℃保存备用。二、RNA逆转录合成cDNA使用逆转录试剂盒（VazymeR312-01），将500ng的RNA逆转录为cDNA。冰上操作，每个反应体系20µL，如下：试剂使用量5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.环状RNA circ-26782在制备脊髓损伤诊断试剂中的应用，所述环状RNA circ-26782的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，首尾连接成环状结构。/n

【技术特征摘要】
1.环状RNAcirc-26782在制备脊髓损伤诊断试剂中的应用，所述环状RNAcirc-26782的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，首尾连接成环状结构。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂还包括检测所述环状RNAcirc-26782的引物对，该引物对序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。


3.环状RNAcirc-26782在筛选脊髓损伤治疗药...

【专利技术属性】
技术研发人员：巫荣华，刘梅，钱晓伟，刘炎，于彬，马靖怡，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32