一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，由以下体积分数的组分组成：卤代烃或液态烃类20％～60％、酯类溶剂20％～50％、醇类溶剂20％～50％；密度大于1g/cm3，熔点小于0℃，沸点大于150℃，20℃下在水中的溶解度小于1.5g/100ml。本发明专利技术还提供所述氯仿替代试剂在核酸提取过程中，代替氯仿进行萃取有机相，使有机相和水相分层，分离出核酸水相的应用。氯仿替代试剂能完全替代氯仿在核酸提取中的作用，提取的核酸浓度和使用氯仿时相当，且没有氯仿的有毒、易挥发、受管制等各种缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂
本专利技术涉及一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，具体涉及一种在核酸提取过程中，使有机相和水相分层，分离出核酸的氯仿替代试剂。
技术介绍
酚氯仿抽提核酸是最经典的核酸提取技术，《分子克隆实验指南.精编版》中仍在大量使用酚氯仿抽提技术。苯酚由于类似苯而呈现出非极性分子的特点，使用酚抽提核酸时，其作用是先使蛋白质变性，再由于蛋白分子表面含有很多非极性基团(含有苯环的氨基酸)，根据相似相溶的原理，蛋白分子会溶解于苯酚相中，而核酸则由于亲水的特性溶于水相。但是苯酚由于含有一个羟基，使得苯酚又具有一部分极性分子的特性，能微溶于水。所以在用酚抽提核酸的过程中，必须加入与苯酚亲和力非常强的氯仿，以加速有机相与水相的分层，并以此去除核酸溶液中残留的苯酚。氯仿是一种无色透明液体，有特殊气味，味甜，高折光，不燃，质重，易挥发的试剂。氯仿纯品对光敏感，遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气(碳酰氯)和氯化氢。对人体有毒害作用，主要作用于中枢神经系统，且被世界卫生组织国际癌症研究机构列入2B类致癌物清单中，因此《分子克隆实验指南.精编版》679页，附录4明确指出使用氯仿时要戴合适的手套和安全眼镜并始终在化学通风橱里进行。此外，根据《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》，氯仿受公安部门管制。虽然氯仿有上述的严重缺陷，但由于其在核酸提取中不可替代的作用，依旧沿用至今。特别是经典的Trizol试剂法提取RNA，必须使用氯仿，而Trizol试剂至今在RNA提取市场上依然占有非常大的比重。市场上各家公司的Trizol试剂或相关产品都会要求用户自行准备氯仿，由于氯仿是易制毒化学试剂而受到管制，购买及使用程序非常不便，且有毒有害，使用时对设备和环境要求较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于核酸提取中分离核酸时必须使用的氯仿替代试剂，该试剂可替代氯仿在核酸提取中的作用，萃取苯酚等非极分子，使有机相和水相分层，分离出核酸溶液，并且该试剂不具有氯仿的缺陷，无毒或低毒，不易挥发，无需在通风橱操作，使用不受管制。本专利技术采用的技术方案是：一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，所述替代试剂由以下体积分数的组分组成：卤代烃或液态烃类20％～60％、酯类溶剂20％～50％、醇类溶剂20％～50％；密度大于1g/cm3，熔点小于0℃，沸点大于150℃，20℃下在水中的溶解度小于1.5g/100ml。进一步，所述卤代烃或液态烃类为四氯乙烯、四氯乙烷、五氯乙烷、四溴乙烷、1,2-二氯丙烷、1,3-二氯丙烷、三氯丙烷、四氯丙烷、苯、二甲苯或辛烷，更优选为卤代烃即四氯乙烯、四氯乙烷、五氯乙烷、1,2-二氯丙烷、1,3-二氯丙烷、三氯丙烷或四氯丙烷，最优选为四氯乙烯、四氯丙烷或五氯乙烷。进一步，所述酯类溶剂为乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸丙酯、丙酸异丙酯、丁酸丙酯、正丁酸异丙酯、戊酸丙酯、异戊酸丙酯、己酸丙酯、己酸异丙酯、庚酸丙酯、辛酸丙酯、辛酸异丙酯、辛酸异丙酯、癸酸正丙酯、癸酸异丙酯、乳酸正丙酯、棕榈酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、丙酸丁酯、丙酸异丁酯、丁酸丁酯、丁酸异丁酯、异丁酸异丁酯、戊酸丁酯、戊酸异丁酯、异戊酸异丁酯、庚酸丁酯、庚酸异丁酯、辛酸正丁酯、辛酸异丁酯、乙酸异戊酯、戊酸戊酯、乙酸乙酰乙酯、2-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、4-乙酰基丁酸乙酯；邻氨基苯甲酸甲酯、磷酸三(2-氯乙基)酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯、壬酸烯丙酯、对甲苯磺酸正丁酯、癸二酸二乙酯、癸二酸二异丙酯、癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二丁酯，优选为乙酸乙酰乙酯、磷酸三(2-氯乙基)酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯或邻苯二甲酸二丁酯，更优选为乙酸乙酰乙酯、正硅酸丙酯或邻苯二甲酸二丁酯。进一步，所述的醇类溶剂为C4～C12的脂肪醇，进一步，所述醇类溶剂为丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、己醇、庚醇、辛醇、异辛醇、壬醇、异壬醇、癸醇或异癸醇，优选为正戊醇、异戊醇、己醇、庚醇、辛醇或异辛醇，更优选为异戊醇、己醇或辛醇。更进一步，本专利技术所述的氯仿替代试剂优选为以下三种配方之一，所述配方中的组分均为体积分数：配方1：正硅酸丙酯30％，四氯乙烯50％，辛醇20％；配方2：乙酸乙酰乙酯20％，四氯丙烷50％，异戊醇30％；配方3：邻苯二甲酸二丁酯50％，五氯乙烷30％，己醇20％。本专利技术的氯仿替代试剂的要求是在常温下为液态的试剂，且满足以下条件：1.分子结构属于非极性分子，与苯酚有非常好的相溶性且不溶于水，其范围包括酯类，卤代烃、醇类等。2.要求该化学试剂沸点越高越好，低挥发性，在室温条件下可以长时间维持液态。3.要求该化学试剂密度最好大于或接近1g/cm3，萃取苯酚后，有机相应处于下相。4.该化学试剂要求具有无毒或低毒的特性。5.与核酸的亲和性差，也不会与核酸产生化学反应。由于同时具备上述5种条件的化学试剂并不存在，本专利技术采用的方法是将几种化学试剂调配到一起，组成一种缓冲体系，达到各项使用性能均优于氯仿的替代试剂。本专利技术中，采用三组分的混合配制方式，氯仿替代试剂试剂由卤代烃或液态烷烃、酯类溶剂、醇类溶剂混配而成。这些组分的选择和调配都是基于本专利技术的技术目的而进行的。由于本专利技术的密度要求大于1g/cm3，所以必须有卤代烃或烷烃作为组成成分，且优选密度大的卤代烃，用于调整缓冲溶液的密度，卤代烃的含量在20％-60％(体积比)范围。本专利技术的酯类或者醇类优选低毒或无毒，沸点高且密度大的酯类或者醇类溶剂。本专利技术还提供所述氯仿替代试剂在核酸提取过程中，代替氯仿进行萃取有机相，使有机相和水相分层，分离出核酸水相的应用。所述应用较常见的是在酚氯仿抽提核酸方法中代替氯仿萃取苯酚分离核酸，比如在《分子克隆指南.精编版》第7章方案7.1“用酸性苯酚-硫氰酸胍-氯仿从细胞和组织中抽提纯化RNA”，以及CTAB法从植物叶片提取DNA等方法。其他以替代氯仿在核酸提取中的萃取苯酚或其他有机物为目的的应用，也属于本专利技术的保护范围。具体的应用方式包括且不限于在各类市场上商品化的RNA或DNA提取试剂或者试剂盒中，使用本专利技术提供的氯仿替代试剂来代替其中的氯仿，如Trizol试剂(invitrogen公司产品)、RNAisoPlus(Takara公司产品)、RNAsimple总RNA提取试剂盒(北京天根生化产品)、超纯总RNA提取试剂盒(杭州新景生物产品)、高多糖多酚植物总RNA试剂盒(杭州新景生物产品)、植物/真菌DNA试剂盒(杭州新景生物产品)等。本专利技术配制成的氯仿替代试剂的商品名命名为“BufferEX”，理化性质如下：熔点：-30℃～-50℃沸点：150～180℃溶解度(水)：1～1.5g/100ml(20℃)密度：1.1～1.2g/ml外观:无色液体，不易挥发，具有特殊的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，其特征在于所述氯仿替代试剂由以下体积分数的组分组成：卤代烃或液态烃类20％～60％、酯类溶剂20％～50％、醇类溶剂20％～50％；密度大于1g/cm

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，其特征在于所述氯仿替代试剂由以下体积分数的组分组成：卤代烃或液态烃类20％～60％、酯类溶剂20％～50％、醇类溶剂20％～50％；密度大于1g/cm3，熔点小于0℃，沸点大于150℃，20℃下在水中的溶解度小于1.5g/100ml。


2.如权利要求1所述的氯仿替代试剂，其特征在于所述卤代烃或液态烃类为四氯乙烯、四氯乙烷、五氯乙烷、四溴乙烷、1,2-二氯丙烷、1,3-二氯丙烷、三氯丙烷、四氯丙烷、苯、二甲苯或辛烷。


3.如权利要求1所述的氯仿替代试剂，其特征在于所述酯类溶剂为乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸丙酯、丙酸异丙酯、丁酸丙酯、正丁酸异丙酯、戊酸丙酯、异戊酸丙酯、己酸丙酯、己酸异丙酯、庚酸丙酯、辛酸丙酯、辛酸异丙酯、辛酸异丙酯、癸酸正丙酯、癸酸异丙酯、乳酸正丙酯、棕榈酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、丙酸丁酯、丙酸异丁酯、丁酸丁酯、丁酸异丁酯、异丁酸异丁酯、戊酸丁酯、戊酸异丁酯、异戊酸异丁酯、庚酸丁酯、庚酸异丁酯、辛酸正丁酯、辛酸异丁酯、乙酸异戊酯、戊酸戊酯、乙酸乙酰乙酯、2-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、4-乙酰基丁酸乙酯、邻氨基苯甲酸甲酯、磷酸三(2-氯乙基)酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯、壬酸烯丙酯、对甲苯磺酸正丁酯、癸二酸二乙酯、癸二酸二异丙酯、癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二丁酯。

【专利技术属性】
技术研发人员：徐小寅，张文彬，郝梦雅，
申请(专利权)人：杭州新景生物试剂开发有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33