本发明专利技术涉及肿瘤药物技术领域，尤其涉及一种R‑2HG的应用，其在制备抑制肿瘤药物中的应用；所述的抑制肿瘤药物为抑制胆管癌药物，本发明专利技术中R‑2HG通过改变信号传导而降低CCA细胞增殖，而ERα(雌激素通过雌激素受体α)改变FTO/m6A甲基化的ERα/miR‑16‑5p/YAP1信号传导，这项研究为由IDH1/2突变产生的R‑2HG的抗肿瘤分子机制提供了新颖的见解，并可能有助于开发更有效的新颖治疗策略，以治疗具有或不具有IDH1/2突变的CCA。
【技术实现步骤摘要】
一种R-2HG用于制备抑制肿瘤药物的应用
本专利技术涉及肿瘤药物
，尤其涉及一种R-2HG用于制备抑制肿瘤药物的应用。
技术介绍
胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是起源于胆道上皮细胞的一类恶性肿瘤，是第二大最常见的原发性肝恶性肿瘤。根据解剖结构，CCA分为肝内CCA(ICC)和肝外CCA(ECC)。无痛性黄疸是门诊病人的主要原因。其主要特征是预后差和中位生存期短(约一年)。完整的手术切除与组织学阴性切除切缘和肝移植仍被认为是潜在治愈性治疗的主要手段。由于对肿瘤生物学和分子发病机制的进一步了解，致癌作用的特定基因排列已达成共识，而基因组分析也揭示了CCA中的遗传突变谱。这些基因异常中，在神经胶质瘤、急性髓细胞性白血病(AML)、软骨肉瘤和CCA的研究发现IDH1/2突变在CCA的发生和预后中发挥了重要作用。进一步研究发现，由突变的IDH1/2在三羧酸(TCA)循环中产生的(R)-2-羟基戊二酸(R-2HG)抑制了经典α-酮戊二酸(α-KG)依赖性双加氧酶的活性，改变了表观遗传，细胞外基质成熟和细胞信号传导。功能研究还发现，R-2HG可促进癌变，被认为是α-KG的竞争性合成代谢物。一种副作用较小的药品，不但能够抗包括胆管癌在内的肿瘤还能使患者减少痛苦是十分具有实用价值的。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种R-2HG用于制备抑制肿瘤药物的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种R-2HG的应用，其在制备抑制肿瘤药物中的应用；所述的抑制肿瘤药物为抑制胆管癌药物。优选的，一种验证R-2HG抑制胆管癌细胞增殖的方法，包括以下步骤：S1：先将2个CCA细胞系经过300μMR-2HG处理48小时，然后进行MTT细胞增殖实验；S2：验证内源性R-2HG与外源性R-2HG的结果，应用慢病毒系统在QBC939细胞系中建立过表达的野生型IDH1和突变IDH1(R132H)，进行MTT细胞增殖实验和/或菌落形成实验；S3：运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在QBC939细胞系中构建杂合IDH1R132H突变(IDH1R132H/WT)，通过MTT细胞增殖实验和集落形成试验检验IDH1R132H/WTQBC939细胞中的内源性R-2HG功能；S4：检索GEO数据库，获得一个IDH1/2突变的CCA肿瘤样本的微阵列数据集(GSE107102)，通过针对IDH1/2突变组和野生组的数据比对，获得了738个差异基因，随后，通过在线通路富集分析工具DAVID6.8，获得了排名前20的差异通路，最后，选择同细胞增殖相关联的四个通路，筛选出共同的差异基因：ERα、HIF-1α和GJA1，利用TCGA中临床样本数据，验证肿瘤预后同这3个差异基因的相关性；S5：验证ERα是R-2HG的特定下游基因，在QBC939细胞中敲低ERα，再用R-2HG处理。优选的，所述MTT细胞增殖实验包括以下步骤：将处理好的细胞取出到超净台操作，PBS洗两遍之后，胰酶消化，离心后用1ml培养基重悬，加入DMSO或者R-2HG，细胞计数，将500个细胞种入96孔板中，设3复孔，24小时之后，分别0day1day3day5day7day，按照1：10向96孔板孔内加入MTT溶液，放入细胞孵箱继续培养2小时，随后取出，弃上清，加入100μlDMSO，室温避光摇床10分钟，利用酶标仪检测各孔吸光值来反映细胞活率，检测波长为570nm。优选的，所述S4中，针对ERα、HIF-1α和GJA1差异基因功能的验证，利用TCGA中临床样本数据，验证肿瘤预后同这3个差异基因的相关性。优选的，所述S5中，通过WesternBlot检测分析ERα在DMSO和R-2HG处理组之间的差异表达。优选的，所述S5中，通过慢病毒系统在CCA细胞系中用ERα-shRNA敲低ERα或用ERα-cDNA过度表达ERα。本专利技术的有益效果是：R-2HG通过改变信号传导而降低CCA细胞增殖，而ERα(雌激素通过雌激素受体α)改变FTO/m6A甲基化的ERα/miR-16-5p/YAP1信号传导，这项研究为由IDH1/2突变产生的R-2HG的抗肿瘤分子机制提供了新颖的见解，并可能有助于开发更有效的新颖治疗策略，以治疗具有或不具有IDH1/2突变的CCA。附图说明图1表明IDH1突变产生的R-2HG可能产生抑制CCA细胞的生长；图2表明ERα可能通过改变CCA中的miR-16-5p/YAP1信号传导来调控细胞增殖；图3表明ERα可能通过改变CCA中的miR-16-5p/YAP1信号传导来调控细胞增殖。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。参照图1-3，一种R-2HG的应用，其在制备抑制肿瘤药物中的应用；所述的抑制肿瘤药物为抑制胆管癌药物。实施例1，一种验证R-2HG抑制胆管癌细胞增殖的方法，包括以下步骤：S1：先将2个CCA细胞系经过300μMR-2HG处理48小时，然后进行MTT细胞增殖实验；S2：验证内源性R-2HG与外源性R-2HG的结果，应用慢病毒系统在QBC939细胞系中建立过表达的野生型IDH1和突变IDH1(R132H)，进行MTT细胞增殖实验和/或菌落形成实验；S3：运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在QBC939细胞系中构建杂合IDH1R132H突变(IDH1R132H/WT)，通过MTT细胞增殖实验和集落形成试验检验IDH1R132H/WTQBC939细胞中的内源性R-2HG功能；S4：检索GEO数据库，获得一个IDH1/2突变的CCA肿瘤样本的微阵列数据集(GSE107102)，通过针对IDH1/2突变组和野生组的数据比对，获得了738个差异基因，随后，通过在线通路富集分析工具DAVID6.8，获得了排名前20的差异通路，最后，选择同细胞增殖相关联的四个通路，筛选出共同的差异基因：ERα、HIF-1α和GJA1，利用TCGA中临床样本数据，验证肿瘤预后同这3个差异基因的相关性；S5：验证ERα是R-2HG的特定下游基因，在QBC939细胞中敲低ERα，再用R-2HG处理。所述MTT细胞增殖实验包括以下步骤：将处理好的细胞取出到超净台操作，PBS洗两遍之后，胰酶消化，离心后用1ml培养基重悬，加入DMSO或者R-2HG，细胞计数，将500个细胞种入96孔板中，设3复孔，24小时之后，分别0day1day3day5day7day，按照1：10向96孔板孔内加入MTT溶液，放入细胞孵箱继续培养2小时，随后取出，弃上清，加入100μlDMSO，室温避光摇床10分钟，利用酶标仪检测各孔吸光值来反映细胞活率，检测波长为570nm。所述S4中，针对ERα、HIF-1α和GJA1差异基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种R-2HG的应用，其特征在于，其在制备抑制肿瘤药物中的应用；所述的抑制肿瘤药物为抑制胆管癌药物。/n
【技术特征摘要】
20201209 CN 20201145118451.一种R-2HG的应用，其特征在于，其在制备抑制肿瘤药物中的应用；所述的抑制肿瘤药物为抑制胆管癌药物。
2.一种验证R-2HG抑制胆管癌细胞增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：先将2个CCA细胞系经过300μMR-2HG处理48小时，然后进行MTT细胞增殖实验；
S2：验证内源性R-2HG与外源性R-2HG的结果，应用慢病毒系统在QBC939细胞系中建立过表达的野生型IDH1和突变IDH1(R132H)，进行MTT细胞增殖实验和/或菌落形成实验；
S3：运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在QBC939细胞系中构建杂合IDH1R132H突变(IDH1R132H/WT)，通过MTT细胞增殖实验和集落形成试验检验IDH1R132H/WTQBC939细胞中的内源性R-2HG功能；
S4：检索GEO数据库，获得一个IDH1/2突变的CCA肿瘤样本的微阵列数据集(GSE107102)，通过针对IDH1/2突变组和野生组的数据比对，获得了738个差异基因，随后，通过在线通路富集分析工具DAVID6.8，获得了排名前20的差异通路，最后，选择同细胞增殖相关联的四个通路，筛选出共同的差异基因：ERα、HIF-1α和GJA1，利用TCGA中临床样本数据，验证肿瘤预后同这3个差异基因的相关性；
S5：验证ERα是R...
【专利技术属性】
技术研发人员：高源，秦锡虎，汤黎明，
申请(专利权)人：常州市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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