本发明专利技术公开了装载有抗炎货物的肺靶向细胞外囊泡(EV)，以及组合物、系统和其制备方法。所公开的EV可含有肺靶向配体，诸如含有肺靶向部分的融合蛋白。还公开了包含含有所公开的融合蛋白的EV的组合物。在一些实施例中，EV装载有抗炎货物。还公开了经工程改造用于产生所公开的EV的EV产生细胞。还公开了一种用于制造所公开的EV的方法，所述方法包括在适合产生EV的条件下培养所公开的EV产生细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于肺部炎症治疗的纳米载体相关申请的交叉引用本申请要求于2018年10月19日提交的美国临时申请第62/747,987号的权益，该临时申请的全部内容通过引用整体并入本文。序列表本申请包含电子形式的、以在2019年10月18日创建的标题为“321501-2340SequenceListing_ST25”的ASCII.txt文件形式提交的序列表。
技术介绍
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的特征是严重的低氧血症、弥漫性双侧肺浸润和肺顺应性降低。目前尚无批准的ARDS治疗方法。
技术实现思路
本文公开了一种纳米载体(nanocarrier)系统，以有效靶向肺细胞并装载有抗炎货物，以在ARDS期间调节肺部炎症。这些纳米载体可以使用多种转染技术(例如，批量电穿孔、纳米电穿孔、组织纳米转染、病毒转染)在体外转染细胞或在体内转染组织后获得。所公开的纳米载体是装载有抗炎货物，诸如微小RNA146a的定制的细胞外囊泡(EV)，并且通过用肺微环境中的特定受体的配体修饰进行功能化，以进行靶向传递。如图1所示，可以通过转染例如编码特定货物或配体的质粒DNA来为EV装载抗炎货物和/或用细胞靶向的配体进行修饰。货物可能根据需要调节的炎症途径而所有不同，并且可以根据靶细胞类型来改变表面修饰。例如，可以使用分别为表面活性剂蛋白A(SPA)和膜糖蛋白CD200编码的质粒基因来靶向II型肺细胞和肺巨噬细胞。用SPA功能化的细胞外囊泡与II型细胞上的受体P63/CKAP4相互作用，而用CD200功能化的细胞外囊泡则优先与肺泡巨噬细胞中的CD200R受体相互作用。EV可以用SDF1功能化，其将与肺血管系统中的受体CXCR7相互作用。例如，当通过血管内方法递送EV时，这可能很有价值。如图2所示，经表面修饰的EV还可以装载有抗炎货物，这些货物是可通过一定浓度梯度扩散到EV中的可透过膜的药理化合物(例如，Y-27632Rho抑制剂，Calbiochem)。在下面的附图和描述中进一步说明了本专利技术的一个或多个实施例的细节。在说明书和附图以及权利要求书中，本专利技术的其他特征、主题和优点将是显而易见的。附图说明图1是在转染细胞或组织后装载有抗炎货物和/或用细胞靶向配体修饰的定制纳米载体的产生的示意图。图2是装载有其他抗炎货物，例如可透过膜的药理化合物的经表面修饰的EV的示意图。图3A至3E示出了体外衍生的策划EV(designerEV)的表征。图3A和3B示出了在纳米转染初级小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)24小时后分离出的装载有miR-146a的策划EV，其粒径范围为200nm，并且EV浓度为每毫升数十亿个颗粒。图3C示出了用编码miR-146A的质粒和假性/对照质粒(*p值＝0.041)进行纳米转染后48小时，从小鼠树突细胞获得的装载有miR-146A的策划EV的qRT-PCR表征。图3D示出了在用这些miR-146A或假性策划EV处理的A549肺上皮细胞和分化的THP-1单核细胞中相对的miR-146A表达(*p值<0.001)。图3E示出了用衍生自PMEF的荧光标记的miR-146a策划EV处理48小时后的C57BL/6小鼠初级肺泡上皮细胞，其中白色箭头突出显示了EV的吸收。图4A至图4F示出了体内衍生的策划EV表征。图4A是体内皮肤的组织纳米转染(TNT)以及随后分离策划EV的示意图。图4B示出了每平方厘米皮肤约十万亿EV数量级的颗粒浓度。图4C示出了在109-135nm范围内的平均粒度。图4D示出了假性策划EV和miR-146a策划EV均呈现出膜EV标记物四跨膜蛋白CD9的阳性表达。图4E示出了这些体内衍生的miR-146A策划EV的qRT-PCR表征，其示出了分子货物的成功装载。图4F和4G示出了标记的策划EV的体内产生，其中在利用编码CD63-GFP的质粒(EV示踪剂)进行皮肤TNT后24小时，与未转染动物的对照组织(图4G)相比，转染的皮肤细胞明显产生了GFP标记的策划EV(白色箭头)。图5A至图5F示出了体内衍生的策划EV调节肺中的炎症。miR-146a策划EV在通气条件下治疗4小时后的效果显示出生理参数改善(图5A至5D)，BAL蛋白含量显著下降(图5E)，以及炎性细胞因子分泌有下降趋势(图5F，*p值＝0.022)。图6A和6B示出了靶向发炎肺部的功能化策划EV。可以将策划EV功能化，以针对肺泡空间的不同细胞区室。图6A示出了从动物收集的器官的体内成像，所述动物利用以CD200配体功能化以靶向肺泡巨噬细胞的策划EV处理24小时。图6B示出了用荧光标记的功能化策划EV处理24小时后的肺组织的IF图像，其示出了成功的肺细胞吸收(箭头)。具体实施方式公开了装载有抗炎货物的肺靶向细胞外囊泡(EV)，以及组合物、系统和其制造方法。所公开的EV可含有肺靶向配体，诸如含有肺靶向部分的融合蛋白。还公开了包含含有所公开的融合蛋白的EV的组合物。在一些实施例中，EV装载有抗炎货物。还公开了经工程改造用于产生所公开的EV的EV产生细胞。还公开了一种用于制造所公开的EV的方法，所述方法包括在适合产生EV的条件下培养所公开的EV产生细胞。所述方法可以进一步涉及从细胞中纯化EV。在更详细地说明本专利技术之前，应理解，本专利技术不限于所描述的特定实施例，因此当然可以与此不同。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不用于限制本专利技术，因为本专利技术的范围将仅由所附权利要求书限制。在提供数值范围的情况下，应理解，所述范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另有明确规定，否则均应保留到下限值单位的十分位)以及任何其他所示的或在所述范围内的中间值都包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在这些较小范围内，并且也应涵盖在本公开内容之内，但要受到所述范围内的任何明确排除的限制。在所述范围包括这些极限值的一个或两个的情况下，排除这些所包括的极限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。本说明书中引用的所有公开和专利均通过引用并入本文，每个单独的公开或专利均被具体地和单独地指出通过引用并入本文，并通过引用并入本文用以公开和描述本专利技术的方法和/或材料，这些公开也因此被引用。任何公开的引用均是为了其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认由于公开在先而使得本公开内容无法早于该公开。此外，提供的发布日期可能与可能需要独立确认的实际发布日期不同。对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文所描述和图示的每个单独的实施例均具有离散的组成和特征，其可以容易地与其他数个实施例中的任何一个的特征分离或组合，而不会脱离本公开的范围或精神。任何所述的方法都可以以所述的步骤顺序或逻辑上可能的任何其他顺序执行。除本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含表面活性剂蛋白A(SPA)或CD200，以及外泌体或溶酶体跨膜蛋白。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181019 US 62/747,9871.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含表面活性剂蛋白A(SPA)或CD200，以及外泌体或溶酶体跨膜蛋白。
2.一种细胞外囊泡，所述细胞外囊泡包含根据权利要求1所述的融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡进一步包含治疗性货物。
4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述治疗性货物包含miR146a。
5.根据权利要求3或4所述的细胞外囊泡，其中所述治疗性货物包含Y-27632。
6.一种细胞，所述细胞包含编码根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：娜塔莉亚·希吉塔卡斯特罗，丹尼尔·加勒戈佩雷斯，萨米尔·格达阿里，约书亚·恩格勒特，香登·塞恩，
申请(专利权)人：俄亥俄州国家创新基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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