大豆Dt1基因编辑位点及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大豆Dt1基因编辑位点及其应用。本发明专利技术的大豆Dt1基因编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’‑TGTATGAGAGAAAGAGACGAGGG‑3’；在大豆基因组的准确定位是19号染色体Dt1基因启动子上游的2029‑2051处，染色体的坐标为45178492‑45178514。该编辑位点是对该基因启动子进行编辑的有效靶标，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得Dt1不同的等位基因突变体。本发明专利技术为调节Dt1的表达量以改变大豆的结荚习性和产量提供了新策略，也为培育大豆新品种和提高大豆产量提供了可靠的手段和素材，对于作物研究和生产具有十分重要的作用。

【技术实现步骤摘要】
大豆Dt1基因编辑位点及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种大豆Dt1基因编辑位点及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。刘耀光教授及其团队研发了高效简便的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统(Maetal.,2016)，在该系统中，可以通过设计不同目标序列的多个导向RNA(sgRNA)，将Cas9蛋白靶向到多个基因组位点上，同时进行多基因编辑，也可以在目的基因的启动子或UTR区域设计靶点，对目的基因的启动子或UTR进行编辑，调节目的基因的表达量。例如，Hendelman等通过对SlWOX9基因的启动子进行编辑产生不同的等位基因，发现SlWOX9在营养和生殖发育中的多效性作用，这对利用基因组编辑在农业中的应用具有重要意义(Hendelmanetal.,2021)。大豆结荚习性是联系大豆开花期与产量性状的桥梁(孔凡江等,2016)。根据花期长短、茎生长状态、茎粗细、节间数、叶大小及茎顶端结荚情况等综合性状，大豆品种被划分为3种类型：有限结荚习性、亚有限结荚习性和无限结荚习性(Bernard,1972)。Liu等利用图位克隆的方法首次克隆了控制无限结荚习性基因位点Dt1，Dt1由GmTFL1b基因编码，将包含GmTFL1b基因全长和启动子基因组片段转化至有限型大豆中，能显著增加大豆节数和延迟顶端花序出现的时间(Liuetal.,2010)。Ping等则克隆了控制亚有限结荚习性的Dt2，是一个含有MADS结构域的基因，与AP1同属于APETALA1/SQUAMOSA(AP1/SQUA)亚家族(Pingetal.,2014)。Dt1对Dt2具有上位性效应，dt1/dt1为有限结荚习性，Dt1/Dt1；Dt2/Dt2为亚有限结荚习性(Dt1和Dt2都是纯合显性的才是亚有限)，Dt1/Dt1；dt2/dt2为无限结荚习性(Dt1是纯合显性，dt2是纯合隐性的才是亚有限)(Pingetal.,2014)。从Dt2控制的大豆表型推测Dt2可能不是与拟南芥中的AP1基因功能相似，在FMs中抑制TFL1的表达，Dt2可能是在大豆顶端分生组织(SAMs)中抑制Dt1的表达，使大豆的SAMs转化为生殖花序(Pingetal.,2014)。最近，Chen等通过CRISPR/Cas9技术同时敲除了大豆AP1基因的四个同源基因(AP1a、AP1b、AP1c和AP1d)，获得了纯合的ap1aap1bap1cap1d四突变体。表型分析结果证明，ap1突变后主茎节数增加。进一步研究表明AP1基因是通过抑制Dt1的表达来控制主茎节数的发育与形成(Chenetal.,2020)。此外，Yue等研究发现大豆中存在Dt1/FT5a/FDc1-AP1-Dt1负反馈竞争抑制环，来控制大豆主茎节数的发育(Yueetal.,2021)。这些新发现让我们更深入的认知Dt1在调控大豆结荚习性中的作用，进而对提高大豆适应性和产量奠定了理论基础；同时为利用Dt1基因的自然变异进行分子设计育种改良大豆单株产量性状提供了可能。然而，目前为止，还没研究报道通过CRISPR/Cas9技术对Dt1的启动子进行编辑以改变Dt1的的表达量，进而改变大豆的结荚习性和产量性状。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大豆Dt1基因编辑位点。本专利技术的另一目的在于提供上述大豆Dt1基因编辑位点的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种培育Dt1突变体结荚习性和产量改良大豆品种的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种大豆Dt1基因编辑位点，为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-TGTATGAGAGAAAGAGACGAGGG-3’(SEQIDNO.1)；该位点在大豆基因组的准确定位是19号染色体Dt1基因启动子上游的2029-2051处，染色体的坐标为45178492-45178514(图1)。所述的编辑位点针对Dt1基因的启动子进行编辑，以改变Dt1的的表达量，进而改变大豆的结荚习性和产量性状。所述大豆Dt1基因编辑位点3’端含有GGG，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，介导Cas9核酸内切酶靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂，从而诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入或删除核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的删除或插入，造成目标靶点附近的突变。含有上述大豆Dt1基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9。所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆Dt1基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，所得sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过BsaI酶切后连接得到。所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d。上述大豆Dt1基因编辑位点在改变大豆的结荚习性和产量中的应用。一种培育Dt1突变体结荚习性和产量改良大豆品种的方法，具体包括以下步骤：(1)按照如SEQIDNO.1所示大豆Dt1基因编辑位点的序列合成sgRNA；(2)在sgRNA的5’端添加碱基GTCA，获得如SEQIDNO.2所示核苷酸序列，将其反向互补得到sgRNA的反向序列，在其5’端添加碱基AAAC，获得如SEQIDNO.3所示核苷酸序列；将SEQIDNO.2与SEQIDNO.3退火，形成双链DNA；(3)构建sgRNA表达盒：将步骤(2)形成的双链DNA连接至sgRNA载体前；(4)将表达载体与步骤(3)中所述sgRNA表达盒连接，得到Cas9sgRNA重组表达载体；(5)将步骤(4)中所述Cas9sgRNA重组表达载体转化至发根农杆菌，并侵染大豆子叶；(6)除草剂筛选，得到转基因植株。步骤(3)中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d；步骤(4)中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9；步骤(3)中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤(4)中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切；步骤(5)所述发根农杆菌优选为K599。步骤(6)所述筛选转基因系采用的除草剂优选为Basta。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的Dt1基因的编辑位点是对该基因启动子进行编辑的有效靶标，可对Dt1基因的启动子进行编辑，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得Dt1不同的等位基因突变体。本专利技术为调节Dt1的表达量以改变大豆的结荚习性和产量提供了新策略，也为培育大豆新品种和提高大豆产量提供了可靠的手段和素材，对于作物研究和生产具有十分重要的作用。附图说明图1为编辑位点(基因上游2029-2051)在大豆基因组上的位置示意图。图2为插入有编辑位点T1的Cas9sgRNA表达载体示意图，Cas9sgR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆Dt1基因编辑位点，其特征在于，所述编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-TGTATGAGAGAAAGAGACGAGGG-3’；该位点在大豆基因组的准确定位是19号染色体Dt1基因启动子上游的2029-2051处，染色体的坐标为45178492-45178514。/n

【技术特征摘要】
1.一种大豆Dt1基因编辑位点，其特征在于，所述编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-TGTATGAGAGAAAGAGACGAGGG-3’；该位点在大豆基因组的准确定位是19号染色体Dt1基因启动子上游的2029-2051处，染色体的坐标为45178492-45178514。


2.根据权利要求2所述大豆Dt1基因编辑位点，其特征在于，所述大豆Dt1基因编辑位点3’端含有GGG，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，介导Cas9核酸内切酶靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂，诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入或删除核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的删除或插入，造成目标靶点附近的突变。


3.含有权利要求1所述大豆Dt1基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。


4.根据权利要求3所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9；所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。


5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆Dt1基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，所得sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过BsaI酶切后连接得到；
所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d。


6.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔凡江，陈丽玉，杨涔，廖春梅，
申请(专利权)人：广州大学，
类型：发明
国别省市：广东;44