构树抗菌蛋白BpChiI及其重组表达载体和提高植物对黄萎病抗性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了构树抗菌蛋白BpChiI及其重组表达载体和提高植物对黄萎病抗性中的应用，构树抗菌蛋白BpChiI具有SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，BpChiI对植物病原真菌具抑菌作用；利用根癌农杆菌介导法将其整合到植物基因组中，对黄萎病的抗性显著提高，具有巨大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
构树抗菌蛋白BpChiI及其重组表达载体和提高植物对黄萎病抗性中的应用
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及构树抗菌蛋白BpChiI，含涉及含有编码构树抗菌蛋白BpChiI基因的重组表达载体，以及构树抗菌蛋白BpChiI在提高植物对黄萎病抗性中的应用。
技术介绍
植物病害是长期危害农业生产的自然灾害之一，它不仅引起农作物减产，而且严重威胁到农产品的质量、食品安全和国际贸易，严重时还会引起食物短缺和一系列社会问题(Punja,2004；AgriosGetal.,2005；GisiU.etal.,2009)。植物病害多种多样，其中真菌病害最广泛，危害最为严重。黄萎病是一种世界性的病害，从温带、亚热带到热带地区均有黄萎病发生的报道(PeggGF,2002)。其致病菌是一种土传维管束病原菌，变异频率快，生理小种多，在土壤中可以存活20年之久，能感染200多种植物品种，除单子叶植物以外的所有植物，包括各种蔬菜、果树、农作物、林木、花草等等都是黄萎病菌的寄主，每年全球因黄萎病引起的作物产量损失就达数十亿美元，其中，马铃薯感染黄萎病菌其损失可以达到50％以上，生菜非常容易达到100％，棉花在黄萎病发病严重的年份也容易造成颗粒无收，在所有维管束病害中，黄萎病菌引起的病害损失是最严重的(PeggGF,2002；StevenJ.Klosterman等,2009；AgriosG，2005)。目前，克隆获得的抗黄萎病基因只有来自番茄的Ve1，该基因在生菜中也存在，但是几年之后抗性也丧失，更为重要的是，绝大多数作物缺乏抗黄萎病的抗原，并且难以获得具有抗性的抗原(StevenJ.Klosterman等,2009)。实践证明，选育和推广使用抗病品种是最经济有效的防治措施，面对病原菌的快速变异和生理小种的特异性，创制具有广谱抗性的材料才是解决问题的根本。基因工程可以克服许多传统育种的不足，可使用的基因更多，来源更广。此外，基因工程还可以针对更大范围的病原菌获得更广谱的抗病性，对土壤有益微生物的影响也最小(OwenWally等，2010)。截止目前已有较多利用转基因手段提高作物抗病性的报道，比如，在胡萝卜中超量表达来自木霉的几丁酶基因CHIT36提高了转基因植株对真菌病害的抗性(BaranskiR等，2008)。在番茄和水稻中分别超量表达不同来源的防御素基因RsAFP2和DmAMP提高了它们的抗病性(JhaS等，2009)，在水稻中表达峰毒素基因提高了水稻对白叶枯病的抗性(WeiShi，2016)等等。但是获得的转基因材料仍然不能满足生产需求，尚无成功应用于生产的转基因抗病材料。基因不丰富，抗性不持久是一个重要原因，因此，进一步挖掘不同来源的基因具有重要意义。植物抗病基因工程中，利用抗菌蛋白基因提高植物的抗病性一直受到人们的关注，在植物中表达不同来源的抗菌蛋白能显著提高其对病原菌的抗性(Shukurov,R.Retal.,2010；Kovács,Getal.,2013；Kaur,Jetal.,2017)。抗菌蛋白不仅来源广泛，能直接作用于病原菌，而且作用于病原菌产生的降解产物也可以进一步诱导植物的防御反应，从而提高植物的抗病性。构树属于桑科构属，适应性强，分布广泛，抗逆性强，其树叶、乳液、果实、树皮等都有一定的药用价值(杨小建等，2007)。构树乳汁有治疗皮肤病的先例，但是未对起作用的组分进行分离。因此分离获得构树乳汁抗菌蛋白，阐明其抗病效果，克隆相关基因可以为植物抗病基因工程提供目的基因，对提高植物黄萎病抗性具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供构树抗菌蛋白BpChiI；本专利技术的目的之二在于提供含有编码所述构树抗菌蛋白BpChiI基因的重组表达载体；本专利技术的目的之三在于提供所述构树抗菌蛋白BpChiI或所述重组表达载体在提高植物对黄萎病抗性中的应用；本专利技术的目的之四在于提供提高植物对黄萎病抗性的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、构树抗菌蛋白BpChiI，所述构树抗菌蛋白BpChiI的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。优选的，编码所述构树抗菌蛋白BpChiI的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，或SEQIDNO.17所示核苷酸经过一个或几个碱基的取代且编码相同氨基酸的核苷酸序列。2、含有编码所述构树抗菌蛋白BpChiI基因的重组表达载体。优选的，所述重组表达载体由SEQIDNO.17所示序列连入pLGN-35S-Nos质粒的SmaI和KpnI酶切位点处。3、所述构树抗菌蛋白BpChiI或所述重组表达载体在提高植物对黄萎病抗性中的应用。优选的，所述植物为拟南芥、烟草或棉花。4、提高植物对黄萎病抗性的方法，将编码所述构树抗菌蛋白BpChiI的基因在植物中过表达，获得对黄萎病具有抗性的植物。优选的，所述在植物中过表达的方法将编码构树抗菌蛋白BpChiI的基因构建成重组表达载体，然后通过农杆菌介导获得转基因植物。优选的，所述重组表达载体由SEQIDNO.17所示序列连入pLGN-35S-Nos质粒的SmaI和KpnI酶切位点处而得。优选的，所述植物为拟南芥、烟草或棉花。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过从构树乳汁中分离纯化抗真菌蛋白，然后进行肽指纹图谱分析，再根据肽段序列设计简并引物，利用RACE和YADE等分子生物学手段克隆获得目的基因BpChiI，然后构建基因的植物组成型表达载体，然后再利用基因工程方法，将BpChiI基因整合到拟南芥、烟草和棉花中，获得了正常转录表达的转基因拟南芥、烟草和棉花株系。与非转基因对照相比，BpChiI转基因拟南芥的病情指数可以由对照的47.96降至20.64；转基因烟草的病情指数可以由对照的73.33降至12.50；瞬时表达BpChiI棉花的病情指数可以由对照的73.17降至40.86。表明，BpChiI能显著提高植物对黄萎病的抗性，该专利技术对于促进BpChiI基因在植物抗病基因工程中的应用具有重要意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为BpChiI蛋白的纯化(A：过DEAE-Sepharose柱收集的蛋白液SDS-PAGE分析，其中的2为穿柱液；B：CM-Sepharose柱分离后收集样品的SDS-PAGE分析；C：分子筛分离收集的样品SDS-PAGE分析)。图2为BpChiI抗真菌活性分析(平板内利用滤纸扩散法检测BpChiI的抗真菌活性；1：20mM磷酸盐缓冲液,pH6.2；2：60％丙酮沉淀构树乳汁的蛋白粗提液，总蛋白浓度为374.3μg/mL；3：54μg/mL纯化的BpChiI蛋白液；4：20μg/mLBSA对照)。图3为BpChiI抑制油菜黑斑病菌孢子的萌发(A：不同浓度的BpChiI与油菜黑斑病菌孢子共培养不同时间的萌发率。数值为三次重复试验的平均值±SD。B：30μg/mLBpChiI与油菜黑斑病菌于1/10PDA培养基上共培养6h，8h和10h，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.构树抗菌蛋白BpChiI，其特征在于：所述构树抗菌蛋白BpChiI的氨基酸序列如SEQID NO.18所示。/n

【技术特征摘要】
1.构树抗菌蛋白BpChiI，其特征在于：所述构树抗菌蛋白BpChiI的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。


2.根据权利要求1构树抗菌蛋白BpChiI，其特征在于：编码所述构树抗菌蛋白BpChiI的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，或SEQIDNO.17所示核苷酸经过一个或几个碱基的取代且编码相同氨基酸的核苷酸序列。


3.含有编码权利要求1所述构树抗菌蛋白BpChiI基因的重组表达载体。


4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQIDNO.17所示序列连入pLGN-35S-Nos质粒的SmaI和KpnI酶切位点处。


5.权利要求1～2任一项所述构树抗菌蛋白BpChiI或权利要求3～4任一项所述重组表达载体在提高植物对黄萎病抗性中的应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：李先碧，唐梦，肖月华，范艳华，金丹，裴炎，侯磊，易飞飞，郑雪丽，于晓涵，陈松，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50