一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其应用制造技术

本申请提供了一种分离的能够特异性结合κ‑卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。所述的结构域PpCBM自身不具备酶活力，但与κ‑卡拉胶酶PpCgkCD共同作用可以显著提高PpCgk的比酶活，使其具有更强的底物亲和性和更高的相对催化效率。本申请公开了所述结构域PpCBM的制备方法以及其在构建工程菌株和降解κ‑卡拉胶中的应用。采用所述的结构域PpCBM构建的κ‑卡拉胶工程酶，不但显著增强了水解活性、提高了温度稳定性，而且将水解模式限定进行性水解，在产业发展中具有广阔的应用前景。此外，所述的结构域PpCBM单独也能用于促进κ‑卡拉胶底物的降解。

【技术实现步骤摘要】
一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种碳水化合物结合结构域，具体涉及一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其制备和应用。
技术介绍
卡拉胶(Carrageenan)是从麒麟菜、石花菜、鹿角菜等海洋红藻细胞壁中提取的硫酸化多糖，已经在食品及医药工程方面得到了广泛的应用。卡拉胶是由交替的D-半乳糖和3,6-内醚-D-半乳糖单元组成线性骨架，骨架由交替的β-1,4和α-1,3糖苷键连接，并含有一定比例的硫酸酯盐。根据3,6-内醚-D-半乳糖的含量以及酯类硫酸盐基团的数量和位置，常见的卡拉胶包括κ-卡拉胶、ι-卡拉胶及λ-卡拉胶。其中，κ-卡拉胶是由β-(1→3)-D-半乳糖-4硫酸基和α-(1→4)-3,6-内醚-D半乳糖交替连接而成的硫酸多糖。κ-卡拉胶寡糖在生理学和病理学研究中的生物活性引起了广泛关注，其具备包括抗凝、抗血栓、抗炎、抗病毒、抗肿瘤在内的多种功效，已逐渐成为药物和功能性食品研究与开发的热点。近年来，κ-卡拉胶寡糖在生物体抗氧化和自由基的清除方面也发挥着重要的作用。降解κ-卡拉胶得到的κ-卡拉胶寡糖不仅在黏度上大幅度降低，而且更容易被机体吸收利用，有望在不久的将来成为海洋糖类药物资源库的重要来源。目前最常见的降解κ-卡拉胶的方法包括酸水解法与酶水解法。然而，酸水解法存在以下问题：(1)反应条件剧烈、产物聚合度较难控制；(2)寡糖末端的3,6-内醚-半乳糖在酸性条件下不稳定，往往导致产物结构被破坏。而酶水解法则具有产物纯度高、重复性好以及水解过程绿色无污染等优势，因而逐渐受到青睐。κ-卡拉胶酶特异性作用于κ-卡拉胶的β-4-硫酸-D-半乳糖和α-3,6-内醚-D-半乳糖之间的β-1,4-糖苷键，最终产物为硫酸κ-新卡拉寡糖。目前，研究人员已经发现了若干微生物κ-卡拉胶酶基因，但关于κ-卡拉胶工程酶构建的相关研究却鲜有报道。碳水化合物结合结构域(CarbohydrateBindingModule，简称CBM)，是一类天然存在于碳水化合物活性酶中的、对碳水化合物具有结合能力的独立结构域。研究发现，许多多糖水解酶，尤其是不溶性多糖水解酶具有CBM。CBM本身不具有明显水解活性，但通过其与底物的特异性结合，提高了底物周围相对酶的浓度，定向引导底物接近酶催化区，同时还破坏了多糖底物结构，从而有效促进了酶与底物的缔合，显著提高多糖水解酶的水解活性。目前，CAZY数据库中已报道的CBM蛋白家族共有81个。根据结构和功能的相似性，CBM可以分为三类，即Type-A(与不溶性多糖表面结合的CBM),Type-B(与糖链结合的CBM),Type-C(与糖分子结合的CBM)。但是，目前尚未有特异性结合κ-卡拉胶的CBM结构域的报道。
技术实现思路
针对现有技术中κ-卡拉胶工程酶构建研究较少的现状，本申请提供了一种分离的能够特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM。采用所述的结构域PpCBM构建的κ-卡拉胶工程酶，不但显著增强了水解活性、提高了温度稳定性，而且将水解模式限定进行性水解，在产业发展中具有广阔的应用前景。本专利技术的技术方案：一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，所述结构域PpCBM的氨基酸序列选自如下(1)、(2)或(3)：(1)如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；(2)如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具备特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列；(3)与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列同源性≥85％，且所表达结构域具有特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列。编码所述的结构域PpCBM的核苷酸序列选自如下(1)、(2)、(3)或(4)：(1)如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；(2)与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(3)与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列同源性≥85％，且其所表达结构域具有特异性结合κ-卡拉胶的核苷酸序列；(4)与(1)、(2)或(3)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。一种分离的表达载体，含有如前所述的编码PpCBM结构域的核苷酸序列的表达载体。一种宿主细胞，包含如前所述的分离的表达载体。所述的结构域PpCBM的制备方法，包括以下步骤：(a)将编码所述结构域PpCBM的核苷酸序列克隆入整合型载体中，构建表达载体；采用的穿梭载体是pNCMO2，所述pNCMO2的表达启动子是来自宿主菌细胞壁蛋白的P2启动子；(b)将表达载体导入短芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)中进行表达；(c)经纯化，得到所述分离的结构域PpCBM。所述分离的结构域PpCBM为天然存在或人为进行改造的、与PpCBM结构具有相同或相似性的蛋白结构域。所述的结构域PpCBM自身不具备酶活力，但与κ-卡拉胶酶PpCgkCD共同作用可以显著提高PpCgk的比酶活，使其具有更强的底物亲和性和更高的相对催化效率。这是因为，结构域PpCBM能够特异性与κ-卡拉胶底物结合，从而有效促进酶与底物的缔合；具体包括以下三个方面：(1)其C末端能够与底物特异性结合，提高底物周围相对酶浓度，通过底物的临近效应提高酶活力；(2)定向引导底物接近κ-卡拉胶酶的催化区；(3)能够非催化性地破坏κ-卡拉胶的微晶结构。此外，所述的结构域PpCBM能够提高κ-卡拉胶酶的温度稳定性；添加了结构域PpCBM的κ-卡拉胶酶PpCgk，温度稳定性显著提高。同时，所述的结构域PpCBM对κ-卡拉胶酶的水解模式有影响；无论作为底物的是溶解状或胶体状κ-卡拉胶，结构域PpCBM都会让使其更倾向于呈现进行性水解，从而解决了水解产物不可控的问题。所述的结构域PpCBM在构建工程κ-卡拉胶酶中的应用，将PpCBM结构域融合到κ-卡拉胶酶的N端或C端，即可构建工程κ-卡拉胶酶。所述的结构域PpCBM在制备κ-卡拉胶寡糖中的应用，具体为：(1)将PpCBM结构域融合到κ-卡拉胶酶的N端或C端，构建工程κ-卡拉胶酶；(2)采用所述工程κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶，制备κ-卡拉胶寡糖。所述的结构域PpCBM在降解κ-卡拉胶中的应用，将适量PpCBM结构域直接添加到κ-卡拉胶底物中。一种特异性固定于κ-卡拉胶的融合蛋白，包括如前所述的PpCBM结构域和目标蛋白。通过PpCBM结构域将目标蛋白固定于卡拉胶上，从而实现相应的功能。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术首次提供了特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，所述的结构域PpCBM不但可以显著提高κ-卡拉胶酶的比酶活和温度稳定性，还实现了底物的进行性水解。(2)本专利技术所述的结构域PpCBM，不但可以通过构建工程菌株实现κ-卡拉胶酶性能的提升，还可以单独用于促进κ-卡拉胶底物的降解。(3)本专利技术所述的结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，其特征在于：所述结构域PpCBM的氨基酸序列选自如下（1）、（2）或（3）：/n（1）如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；/n（2）如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具备特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列；/n（3）与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同源性≥85％，且所表达结构域具有特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，其特征在于：所述结构域PpCBM的氨基酸序列选自如下（1）、（2）或（3）：
（1）如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；
（2）如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具备特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列；
（3）与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列同源性≥85％，且所表达结构域具有特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，其特征在于：编码所述的结构域PpCBM的核苷酸序列选自如下（1）、（2）、（3）或（4）：
（1）如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；
（2）与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
（3）与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列同源性≥85％，且其所表达结构域具有特异性结合κ-卡拉胶的核苷酸序列；
与（1）、（2）或（3）任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。


3.一种分离的表达载体，其特征在于：含有权利要求2所述的编码结构域PpCBM的核苷酸序列的表达载体。


4.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求3所述的分离的表达载体。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光磊，邢梦丹，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37