本发明专利技术公开了miR‑4435‑2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用，属于生物医学领域。本发明专利技术首次发现下调miR‑4435‑2HG和/或GDAP1的表达，能显著抑制AML肿瘤细胞的增殖，并有效促进AML肿瘤细胞凋亡。具体以RNA干扰技术为基础，通过人工合成上述基因靶向的siRNA，实现降低miR‑4435‑2HG和/或GDAP1的表达。本发明专利技术对于开发新的治疗AML的基因药物和提高AML的治疗效果有重要的意义，其具有很大的应用前景和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用
本专利技术属于生物医学领域，涉及miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用。
技术介绍
急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是威胁人类健康的血液恶性肿瘤，是成人中最常见的急性白血病，每100,000人中发病率3.7。并且该疾病进展迅速，除急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)(M3型AML)等低危组患者外，AML患者的长期生存率不足50％，总体预后不容乐观，现有传统的阿糖胞苷联合蒽环类药物的诱导方案治疗方案下，三十余年诸多改进的尝试并未显著提高非APL的AML病人的完全缓解(completeremission，CR)率。因此，急需寻找有效针对AML新的治疗策略。近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶基因合成有效的siRNA，并且选择合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施这一靶向治疗措施的重点。而高通量测序技术的飞速发展，为AML患者的诊断和预后提供了越来越精确的预测，从而可以为患者提供更有效的精准治疗。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用；本专利技术的另一目的在于提供一种能抑制miR-4435-2HG的siRNA和一种能抑制GDAP1表达的siRNA。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用。所述抑制剂为以miR-4435-2HG和/或GDAP1作为靶点制备或筛选得到的对其具有抑制作用的分子或制剂，可为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽或抗体中的至少一种。优选的，所述抑制剂为siRNA，其中，抑制miR-4435-2HG表达的siRNA正义链序列为如下之一：si-miR-4435-2HG-1，5’-GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC-3’；si-miR-4435-2HG-2，5’-GCAUGGAACUCGACAGUUA-3’；抑制GDAP1表达的siRNA正义链序列为如下之一：si-GDAP1-1，5’-GGCCACUCAGAUCAUUGAUUAUCUU-3’；si-GDAP1-2，5’-CACUCGCUGUCACAUUGCAUCGACU-3’。一种能抑制miR-4435-2HG表达的siRNA，正义链序列为如下之一：si-miR-4435-2HG-1，5’-GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC-3’；si-miR-4435-2HG-2，5’-GCAUGGAACUCGACAGUUA-3’。一种能抑制GDAP1表达的siRNA，正义链序列为如下之一：si-GDAP1-1，5’-GGCCACUCAGAUCAUUGAUUAUCUU-3’；si-GDAP1-2，5’-CACUCGCUGUCACAUUGCAUCGACU-3’。一种治疗AML药物，包含上述能抑制miR-4435-2HG表达的siRNA和/或能抑制GDAP1表达的siRNA。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术首次提出，miR-4435-2HG和/或GDAP1作为靶点在制备治疗AML药物中的应用，提供了一种针对AML新的有效治疗策略。2、本专利技术的抑制miR-4435-2HG和GDAP1表达的siRNA能高效抑制抑制miR-4435-2HG和GDAP1基因的表达，其中能高效抑制miR-4435-2HG的siRNA的mRNA的下调程度达到40％～60％，能高效抑制GDAP1的siRNA的mRNA的下调程度达到80％～90％。3、本专利技术的抑制miR-4435-2HG和GDAP1表达的siRNA能显著抑制AML肿瘤细胞的增殖，并有效促进AML肿瘤细胞凋亡。4、本专利技术的siRNA序列对于开发新的治疗AML的基因药物和提高AML的治疗效果有重要的意义，能显著降低传统治疗药物的耐药问题，其具有很大的应用前景和经济价值。附图说明图1是实施例1的部分实验结果图；其中，图A是实施例中敲低miR-4435-2HG或GDAP1后，使用定量实时RT-PCR(qRT-PCR)检测miR-4435-2HG或GDAP1在THP-1细胞中的表达水平结果图；图B是实施例中通过流式细胞术检测到的THP-1细胞凋亡的代表性图；图C是在三个重复实验中分析了siRNA转染THP-1细胞后的凋亡率统计结果图；图D是在三个重复实验中分析了siRNA转染THP-1细胞后使用CCK8试剂盒细胞活力的统计结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1(1)5-10×106个人单核细胞白血病细胞(细胞株THP-1，ATCC)中加入1毫升TRIZOL试剂。(2)总RNA提取2.1将处理过的样本置于冰上，反应5分钟后，加入氯仿0.2毫升，充分混匀(15秒)后置冰上2-3分钟，低温高速(2-8℃，12000g)离心15-30分钟；2.2小心吸取上层液体(约占总体积50％)转移至1.5毫升新管中，加入0.5毫升异丙醇并混匀，冰上放置10分钟后低温高速离心10-20分钟；2.3去上清并用1毫升75％乙醇(-20℃)洗涤两次(2-8℃，10000g)，每次均混匀30秒后，离心5-10分钟；2.4去上清，再离心一次，去除剩余的乙醇；2.5将洗涤后的样品于低温真空离心机中干燥5-10分钟；2.6加入超净水(BiotecxBL-5700)50微升(视情况可适当增加或减少)混匀。2.7取2微升RNA溶液稀释至400微升，于紫外线分光光度仪中检测样品在A260nm波长的光密度估计样品的纯度和含量(1ODA260nm＝40微克/毫升)，RNA总量＝OD数×400微克；2.8RNA样品加入0.1容积(5微升)的3MNaAC(醋酸钠)和2倍容积的乙醇(100微升)后，保存于-70℃备用。(3)RT-PCR3.1将500ngRNA，0.5μloligo(dT)(0.5μg/反应)，0.5μl随机引物(0.5μg/反应)和无RNase的双蒸馏水(ddH2O)(最多5μl)按比例混匀，并在70℃下孵育5分钟后，迅速于冰上冷却5分钟；3.2加入4.0微升GoScriptTM5×反应缓冲液，1.7微升MgCl2(最终浓度2.0mM)，1.0微升0.5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用，其特征在于：
所述基因抑制剂为以miR-4435-2HG和/或GDAP1作为靶点制备或筛选得到的对其具有抑制作用的分子或制剂。
3.根据权利要求1所述的miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用，其特征在于：
所述基因抑制剂为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽或抗体中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用，其特征在于：
所述基因抑制剂为siRNA，其中，抑制miR-4435-2HG表达的siRNA正义链序列为如下之一：
si-miR-4435-2HG-1，5’-GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC-3’；
si-miR-4435-2HG-2，5’-GCAUGGAACUCGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：李扬秋，陈存特，余锡宝，曾成武，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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