一种干细胞冻存液及干细胞冻存方法技术

本发明专利技术提供一种干细胞冻存液及干细胞冻存方法，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：无血清GT‑T551H3培养基，该培养基中包含有50％～60％的α‑MEM基础培养基；15％～20％的人血白蛋白，浓度为15～35g/l；1％～5％的磺基水杨酸；5％～10％的乙酰胺；8％～12％的二甲基亚砜；其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:1～1:10。本发明专利技术提供的干细胞冻存液具有优点；不含有动物血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性；含有磺基水杨酸和乙酰胺成分可以防止细胞冻存过程中形成冰晶而损坏。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞冻存液及干细胞冻存方法
本专利技术涉及细胞冻存
，更具体地，涉及一种干细胞冻存液及干细胞冻存方法。
技术介绍
干细胞，是一种多功能细胞，具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞，是处于细胞系起源顶端的最原始细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。在成体的器官中，干细胞可以通过不断分裂来修复组织。组织器官的损伤和功能衰竭一直以来是人类健康所面临的一大难题，完美地修复或替代因疾病、战伤、意外事故或遗传因素所造成的组织、器官或肢体的伤残一直是人类的梦想，也是难以攻克的医学高峰。目前的治疗方案均难以完全修复受损的组织、器官或使其功能得以长期恢复。干细胞是对疾病进行基因治疗的理想载体。造血干细胞具有自我更新、多向分化重建长期造血、采集和体外处理容易等特点。因此是基因治疗最理想的载体细胞之一，以此为基础的基因治疗，在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景。但是，干细胞在使用前，需要提前准备好并冻存处理，冻存是将细胞放在低温环境，减缓细胞代谢，以达到长期储存的一种技术。其原理是将细胞置于-196℃液氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，在需要的时候通过复苏细胞即可使用。细胞冻存时向细胞悬液中加入保护剂，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结的条件下，细胞内水分渗透出细胞外，减少细胞内冰晶形成，从而避免细胞在冰冻过程中的损伤。目前，干细胞冻存主要是采取-196℃液氮超低温条件下保存，细胞在超低温条件下，代谢功能停滞，细胞可长时间保存，当需要用细胞时，取出冻存的细胞在37℃水浴中快速解冻，即可恢复细胞的活性及功能。但是现有的干细胞冻存方法中，只解决了干细胞和肿瘤细胞的冻存，而干细胞冻存方法还未能很好地解决。由于干细胞的细胞结构和细胞特性，用以往的细胞冻存液及冻存方法冻存干细胞时，干细胞易受到冰晶损伤，复苏后细胞活率低，细胞增殖数量不足，细胞易老化，效率低下，冻存质量不高、细胞复苏后活性差以及成活率不高等问题。
技术实现思路
为了克服现有技术中干细胞冻存方法存在的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种干细胞冻存液及用该冻存液冻存干细胞的方法，该干细胞冻存液能有效地保护干细胞，避免干细胞在冻存的过程中受到损伤，提高干细胞复苏后成活率，并保证干细胞复苏后的生理功能和生物学特性，延长干细胞的存活期，减少干细胞表面抗原的丢失。本专利技术的目的在于提供一种干细胞冻存冻及干细胞冻存方法，有效解决干细胞长期存储、长时间运输、使用灵活性等。本专利技术的目的之一通过下述的方案实现：一种干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有50％～60％的α-MEM基础培养基；15％～20％的人血白蛋白，浓度为15～35g/l；1％～5％的磺基水杨酸；5％～10％的乙酰胺；及8％～12％的二甲基亚砜；其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:2～1:10。较好地，所述干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有55％的α-MEM基础培养基；18％的人血白蛋白，浓度为25g/l；2％的磺基水杨酸；8％的乙酰胺；及10％的二甲基亚砜；其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:4。本专利技术的目的之二在于提供一种干细胞冻存方法，其使用上述冻存液对干细胞进行冻存。较好地，所述干细胞冻存方法中，需要用所述冻存液重悬干细胞，将干细胞的密度调至1.0×107～2.0×107/ml，吹打均匀后，将所述含干细胞的冻存液注入2ml或5ml冻存管中，对干细胞进行冻存。较好地，所述干细胞冻存方法中，干细胞冻存还包括如下步骤：将装有所述干细胞的冻存管放入-80℃冷冻箱中，预冷冻12小时；取出冻存管，转入液氮中永久保存。较好地，所述干细胞冻存方法中，所述干细胞为间充质干细胞。较好地，所述干细胞冻存方法中，所述间充质干细胞包括脐带干细胞、骨髓间充质干细胞及脂肪干细胞。本专利技术提供的干细胞冻存液具有以下优点：1、不含有动物血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性；2、含有磺基水杨酸和乙酰胺成分，磺基水杨酸是非渗透性冷冻保护剂，其本身不能渗透到细胞内，可以降低培养基中自由水的含量，进而减少细胞内冰晶形成，从而减低细胞破损；乙酰胺则属于渗透性冷冻保护剂，其与二甲基亚砜组合，一方面与细胞外溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程，进而减少冰晶形成；另一方面，在细胞冷冻悬液完成凝固之前，渗透到细胞内，并在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，可以防止细胞内水分过度外渗，避免细胞过分脱水皱缩。3、采用本专利技术干细胞冻存液冻存干细胞，室温下转至在-80℃下冻存几个小时后，直接转至液氮中进行永久冻存，中间省去由室温转至-20℃冻存几个小时后，在转存-80℃这个流程环节。采用这种干细胞冻存干细胞，操作简单，可以避免豁免减少细胞在转换冻存时的破损，提高了干细胞冻存效果，且可以保证细胞在接近冰点时细胞内水分不会结晶，保证复苏后细胞的活性和细胞增殖能力不受影响。附图说明图1a、1b、1c分别为人脐带干细胞冻存前后的形态图；其中，图1a为干细胞冻存前细胞形态图；图1b为采用实施例2配置的冻存液冻存一个月后复苏后的脐带干细胞形态图；图1c为采用对比例1配置的冻存液冻存一个月后复苏后的脐带干细胞形态图；显微镜放大倍数为100倍；图2为脐带干细胞冻存前后细胞活性曲线图；图3a、3b、3c分别实施例2和对比例1配置的冻存液冻存前后脐带干细胞对表面标志物的流式测试图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本专利技术的目的之一通过下述的方案实现：本专利技术提供的一种干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有50％～60％的α-MEM基础培养基；15％～20％的人血白蛋白，浓度为15～35g/l；1％～5％的磺基水杨酸；5％～10％的乙酰胺；及8％～12％的二甲基亚砜；其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为：1:2～1:10。这种干细胞冻存液，采用无血清培养基，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞冻存液，其特征在于，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：/n无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有50％～60％的α-MEM基础培养基；/n15％～20％的人血白蛋白，浓度为15～35g/l；/n1％～5％的磺基水杨酸；/n5％～10％的乙酰胺；及/n8％～12％的二甲基亚砜；/n其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:1～1:10。/n

【技术特征摘要】
1.一种干细胞冻存液，其特征在于，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：
无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有50％～60％的α-MEM基础培养基；
15％～20％的人血白蛋白，浓度为15～35g/l；
1％～5％的磺基水杨酸；
5％～10％的乙酰胺；及
8％～12％的二甲基亚砜；
其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:1～1:10。


2.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：
无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有55％的α-MEM基础培养基；
18％的人血白蛋白，浓度为25g/l；
2％的磺基水杨酸；
8％的乙酰胺；及
10％的二甲基亚砜；
其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:4。

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【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，刘家飞，薛卫巍，
申请(专利权)人：广东先康达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44