分离的核酸分子、重组载体及其应用和培育蛹虫草子实体的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离的核酸分子、重组载体及其应用和培育蛹虫草子实体的方法，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术公开的核酸分子如SEQIDNO.1所示。本发明专利技术公开了一种新的从蛹虫草菌中分离的LaeA基因(SEQIDNO.1)，其能够提高蛹虫草菌的孢子产量和虫草素含量，可用于培育蛹虫草子实体，提高蛹虫草子实体的品质。

【技术实现步骤摘要】
分离的核酸分子、重组载体及其应用和培育蛹虫草子实体的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及一种分离的核酸分子、重组载体及其应用和培育蛹虫草子实体的方法。
技术介绍
蛹虫草(Cordycepsmilitaris)作为一种著名的食药用菌，是虫草属(Cordyceps)的模式种。蛹虫草不仅仅含有多种已知的生物活性成分，如虫草素、虫草酸、虫草多糖等，还含有新型类胡萝卜素，喷司他丁，这些物质对人体有益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供分离的核酸分子、重组载体及其应用和培育蛹虫草子实体的方法。本专利技术提供了一种新的从蛹虫草菌中分离的LaeA基因，如SEQIDNO.1所示，其能够提高蛹虫草菌的孢子产量和虫草素含量，可用于培育蛹虫草子实体，提高蛹虫草子实体的品质。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术提供一种分离的核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述SEQIDNO.1所示的核苷酸是从蛹虫草菌中分离的LaeA基因，该基因的功能目前在蛹虫草中的调控作用未见详细研究。本专利技术通过实施例的研究揭示其功能，该基因能够提高蛹虫草菌的孢子产量和虫草素含量，其可用于培育蛹虫草子实体，提高蛹虫草子实体的品质。第二方面，本专利技术提供一种重组载体，其含有如上所述的核酸分子。可选地，在本专利技术的一些实施方案中，所述重组载体的骨架是pDK2。对于本领域技术人员而言，其能够根据实际需要选择合适的载体骨架装载上述的核酸分子，无论选用何种载体骨架，其可以是表达载体，也可以是克隆载体，只要其装载了本专利技术的核酸分子即属于本专利技术的保护范围。第三方面，本专利技术提供一种重组细胞，其含有如上所述的重组载体。对于本领域技术人员而言，其能够根据实际需要选择合适的宿主细胞装载上述核酸分子或载体，其可以是原核细胞(如大肠杆菌或农杆菌)，也可以是真核细胞或酵母菌等，无论选用何种宿主细胞，只要其含有本专利技术的核酸分子或上述重组载体，即属于本专利技术的保护范围。第四方面，本专利技术提供如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体、或如上所述的重组细胞在培育蛹虫草子实体中的应用。第五方面，本专利技术提供一种提高蛹虫草菌产孢量或虫草素含量的方法，其包括：往目标蛹虫草菌中转入如上所述的核酸分子或如上所述的重组载体以使所述核酸分子在所述目标蛹虫草菌体内过表达。对于本领域技术人员而言，其能够想到采用本领域常规的技术将上述核酸分子导入蛹虫草菌中使其过表达，以提高菌丝体的孢子产量和虫草素含量，以及培养该蛹虫草菌的发酵液中的虫草素含量。可选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述目标蛹虫草菌为蛹虫草菌株Cm01。第六方面，本专利技术提供一种培育蛹虫草子实体的方法，其包括：将过表达如上所述的核酸分子的蛹虫草菌接种至活蛹体内。本专利技术的培育方法能够提高蛹虫草子实体的虫草素含量，有效提高蛹虫草子实体的品质。可选的，在本专利技术的一些实施方案中，采用注射的方式将所述蛹虫草菌接种至活蛹体内。可选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述方法还包括：将接种后的所述活蛹体置于24-26℃条件下培养。可选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述蛹虫草菌为蛹虫草菌株Cm01。第七方面，本专利技术提供给如上所述的核酸分子的检测方法，其包括：使用SEQIDNO.2-3所示的引物对扩增提取自待测蛹虫草菌的核酸模板。需要说明的是，本领域技术人员能够在本专利技术揭示了SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的基础上，能够容易想到采用其他的引物对序列对该核酸分子进行定性检测或定量检测，无论选用何种引物对检测上述的SEQIDNO.1所示的核酸分子，其均属于本专利技术的保护范围。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1：质粒载体pKD2的质粒图谱。图2：不同菌株的基因表达量检测结果：A-检测以LN9为出发菌株的基因表达量，B-检测以Cm01为出发菌株的基因表达量。图3：不同菌株的生长速度和产孢量对比。图4：以Cm01为出发菌株的转化子的发酵液中虫草素和腺苷含量测定。图5：以LN9为出发菌株的转化子的发酵液中虫草素和腺苷含量测定。图6为：接种CmLaeACm01转化子后的蚕蛹在不同时间的生长状态照片。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。下文实施例中所使用的材料如下：1菌株和质粒蛹虫草(C.militaris)野生型菌株Cm01，由中国科学院上海植物生理生态研究所王成树实验室提供；蛹虫草(C.militaris)野生型菌株LN9由上海市农业科学院食用菌研究提供。Cm01和LN9均可以通过市面购买得到。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a和BL21、农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL1感受态细胞均购于上海唯地生物技术有限公司。2培养基PDA培养基：200g土豆，20g葡萄糖，20g琼脂，蒸馏水定容至1000mL。米饭培养基：30g大米，45mL蒸馏水(含0.3％KH2PO4，0.15％MgSO4，2％葡萄糖)，121℃、1h高温灭菌。IM培养基，含有：10mmol·L-1K2HPO4，10mmol·L-1KH2PO4，2.5mmol·L-1NaCl，2mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.7mmol·L-1CaCl2，9μmol·L-1FeSO4·7H2O，4mmol·L-1(NH4)2SO4，10mmol·L-1葡萄糖，5g·L-1甘油，0.4mmol·L-1乙酰丁香酮(AS)，以及40mmol·L-12-(N-吗啉)乙磺酸(MES)。M-100培养基：16gKH2PO4，4gNa2SO4，8gKCl，2gMgSO4·7H2O，1gCaCl2，8mLM-100微量元素溶液(60mgH3BO3，140mgMnCl2·4H2O，400mgZnCl2，40mgNa2MO4·2H2O，100mgFeCl3·6H2O，400mgCuSO4·5H2O)，以及15g琼脂；用蒸馏水定容至1000mL。LB培养基(天根生化科技有限公司)；SDB培养基(美国BD生物公司)。3主要试剂PCR试剂盒、内切酶、T4DNA连接酶和高保真DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；质粒提取试剂盒、蛋白定量检测试剂盒、PCR产物回收试剂盒和提取试剂盒(天根生化科技有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的核酸分子。


3.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求2所述的重组载体。


4.权利要求1所述的核酸分子、权利要求2所述的重组载体、或权利要求3所述的重组细胞在培育蛹虫草子实体中的应用。


5.一种提高蛹虫草菌产孢量或虫草素含量的方法，其特征在于，往目标蛹虫草菌中转入权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的重组载体以使所述核酸分子在所述目标蛹虫草菌体内过表达。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：汪滢，鲍大鹏，邹根，李燕，龚明，唐利华，尚俊军，茅文俊，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31