一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术采用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建Serac1基因大片段敲除的小鼠模型，鉴定出野生型小鼠、杂合型小鼠和纯合型小鼠。并以纯合型F1代Serac1基因敲除的小鼠模型为试验对象，对其进行表型分析、病理学分析以及线粒体复合体表达水平和酶活性进行了鉴定，发现该小鼠模型可以作为研究MEGDEL疾病相关临床表型以及作用基质的动物模型使用，这为Serac1导致线粒体功能异常的分子机制，以期为MEGDEL综合征的诊断和治疗提供新的依据。

【技术实现步骤摘要】
一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法
本专利技术涉及生物
，涉及一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法，具体涉及一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法。
技术介绍
线粒体病是一类由于线粒体功能异常所导致的疾病。线粒体功能异常与癌症、糖尿病、阿尔兹海默综合征等退行性疾病的发生密切相关。线粒体疾病分为线粒体常见病和线粒体罕见病，线粒体罕见病通常包括线粒体脑病伴乳酸酸中毒及卒中样发作综合征(MELAS)，肌阵挛癫痫伴肌肉破碎红纤维综合征(MERRF)，亚急性坏死性脑病(LS)等疾病。统计表明，由线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)系统异常所致的线粒体罕见病在新生儿中的发病率约为1/5000左右。目前线粒体病的诊断需要依据患者的临床症状、生化检测、影像检查、病理结果以及相关的线粒体功能研究及基因检测等。目前线粒体病是临床医学中的一大挑战。线粒体的主要功能是为细胞的生存提供能量，是细胞进行有氧呼吸的重要场所，除了提供能量，线粒体还可以参与细胞的分化、信息传递、凋亡、调控细胞的生长周期等过程。而线粒体的能量生成主要依赖线粒体氧化磷酸化系统(OXPHOS)，所以氧化磷酸化系统发生障碍后线粒体功能也会出现相应异常，从而导致疾病的发生。MEGDEL综合征是3-甲基戊烯二酸尿症(3-methylglutaconicaciduria，3-MGA-uria)伴耳聋、脑病和Leigh综合征，有新生儿低血糖和无病原体感染的类似于败血症的临床特点。虽然目前对该疾病的诊断已经成熟，也检测出较多的SERAC1基因位点的突变，为后续的诊断和治疗提供了很大的帮助，但是文献中对SERAC1基因的致病机制没有研究，只是在2篇文献报道中对SERAC1突变患者的磷脂构成进行了检测，发现SERAC1突变后磷脂酰甘油34：1和36：1的比例构成发生了变化，从而导致心磷脂的代谢发生异常，同时在病人的成纤维细胞中发现有胆固醇的聚集。SERAC1是核基因编码的蛋白，在它的N末端信号序列，在C端有一个丝氨酸脂酶域并包含一个GxSxG的脂肪酶模块，这可能与其调节线粒体磷脂酰甘油的重组和细胞内胆固醇的转运相关，而作者也认为线粒体功能损伤和胆固醇稳态的变化被认为是导致MEGDEL的内在原因。然而这一结论仍然存在较大的争议，因此，后续很多相关的研究出现，但是总体上看这些报道仅限于对于疾病临床表型的分析，对于SERAC1是如何影响线粒体氧化磷酸化复合体酶的活性、如何影响磷脂的代谢以及为何对肝脏存在较严重的影响，这些机制均不明确，这也为疾病的治疗造成一定的限制；同时仅有少数的研究采用了成纤维细胞的模型，通过染色发现细胞中胆固醇聚集，以及通过干扰SERAC1的表达后检测磷脂的构成发生变化，对机制也没有明确研究。目前对于线粒体MEGDEL综合征的研究主要集中于病例研究，没有动物模型研究，而目前动物模型是很好的基因突变研究模型，因此，设计动物模型对其临床特征进行分析研究研究其致病的分子机制具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法，基于CRISPR-Cas9基因敲除技术设计了Serac1-/-小鼠模型，以此对研究对象建立MEGDEL疾病模型并充分了解疾病的相关临床表型，明确SERAC1导致线粒体功能异常的分子机制，以期为MEGDEL综合征的诊断和治疗提供新的依据。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供了一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的sgRNA，所述sgRNA作用位点位于Serac1基因的Intron2和Intron7的非保守区，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。进一步地，Intron2区设计的sgRNA的DNA序列为：5’-tcagcagtccaggattggatagg-3’；Intron7区设计的sgRNA的DNA序列为：5’-gcatataccacatgtaggctggg-3’。本专利技术还提供一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法，所述方法基于CRISPR-Cas9基因敲除技术，所述方法包括以下步骤：步骤1：设计靶向小鼠待敲除Serac1基因的sgRNA；步骤2：sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，获得嵌合体的F0代；对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠，筛选Serac1基因敲除的纯合子代，作为Serac1基因敲除小鼠模型；其中，所述sgRNA作用位点位于Serac1基因的Intron2和Intron7的非保守区，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。优选的是，步骤2中所述的PCR鉴定用引物如下所示：WT-F：5’-agagtcacagtcagcaactctgtgc-3’；WT-R：5’-gttatgcaaccaggatcaccacgg-3’；Mut-F：5’-gagtcacagtcagcaactctgtgc-3’；Mut-R：5’-agttctacgcttcaacccctgcta-3’。本专利技术还提供一种所述的sgRNA在构建Serac1基因敲除小鼠模型中的应用。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术采用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，sgRNAs分别设计在Serac1基因的Intron2和Intron7的非保守区，获得嵌合体的F0代小鼠后进行其基因型鉴定，阳性小鼠再与野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠。待确定F1代小鼠的基因型后，F1代纯合子小鼠为动物模型，对其临床特征进行分析研究，发现SERAC1突变以后，小鼠的肌肉活力减弱，纯合基因型小鼠出生率略低，肝脏的线粒体复合体表达水平以及酶活性均有不同程度的降低，小鼠尿液3-MGA增高，核磁代谢发现小鼠脑部的乳酸有轻微的增高、NAA有轻度下降，小鼠的肝脏组织中胆固醇有聚集等。这些结果也提示我们Sera1突变以后，会引起MEGDEL综合征的相关临床表现。因此，本专利技术构建的Serac1基因敲除的小鼠模型对于MEGDEL综合征的诊断和治疗提供协助作用，并且对于Serac1基因致病机理的研究也提供了一定的线索和动物模型。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为Serac1-/-小鼠模型的设计及鉴定；A.Serac1基因sgRNA设计示意图；B.琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠尾巴基因型，分别为野生型、纯合型和杂合型；C.Westernblot分析小鼠各个组织中Serac1基因的KO效果；图2为Serac1的mRNA水平、蛋白水平以及Serac1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA作用位点位于Serac1基因的Intron2和Intron7的非保守区，所述sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA作用位点位于Serac1基因的Intron2和Intron7的非保守区，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。


2.一种构建Serac1基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法基于CRISPR-Cas9基因敲除技术，所述方法包括以下步骤：
步骤1：设计靶向小鼠待敲除Serac1基因的sgRNA；
步骤2：sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，获得嵌合体的F0代；对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠，筛选Serac1基因敲除的纯合子代，作为Serac1基因敲除小鼠模型...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕建新，方合志，杜苗苗，谢安然，聂珂，李晋，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33