【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于单细胞转录组开发AAV载体和启动子的方法和材料相关申请的交叉引用本申请要求2018年12月28日提交的美国专利申请系列号62/785,818的权益。该在先申请的公开内容视为本申请公开的一部分(且通过引用纳入本文)。有关联邦资助的研究的声明本专利技术是在国立卫生研究院授予的MH113095下由政府资助完成。政府对本专利技术拥有一定的权利。
技术介绍
1.
本文涉及用于基于单细胞转录组开发腺相关病毒(AAV)载体和启动子的方法和材料。例如，本文提供了用于创建有效AAV载体的高效且高通量的方法。2.背景信息高效且靶向的基因递送是基因疗法和基于回路的工具例如光遗传学成功的基础。在所需细胞类型中足够水平的基因表达是至关重要的，并且理想地，为了精确靶向治疗、患者安全和回路特异性操纵，脱靶表达应当最小化。一种用于基因疗法的有吸引力的载体系统是基于基因工程改造和修饰的腺相关病毒(AAV)。然而，现有的创建AAV的筛选方法需要更大量的细胞，并且在多轮挑选时间内只聚焦于单一细胞类型。这些也是基于DNA筛选。因此，需要更高效和更高通量的方法用于创建用于基因治疗的AAV载体。
技术实现思路
本文提供了用于创建AAV载体和启动子序列的高通量方法，其对多种细胞类型具有高效率且/或特异性。在一些实施方式中，首先，创建包含多种变体(在约20、或约50、或约100、或约1000或约10,000、或约10,000、或约1,000,000和高达约106或约107种变体之间)的AAV突...
【技术保护点】
1.一种方法，其包括：/n(a)创建AAV突变体或启动子的文库，其中文库内的每种AAV包含独特的DNA条码，或每种启动子构建体包含独特的DNA条码，/n(b)利用双重(对于衣壳文库)或三重(对于启动子文库)转染方案将AAV突变体或启动子包装进包装细胞系中，/n(c)将AAV突变体文库递送进动物宿主的一种或多种组织中，或感染培养中的组织，/n(d)在体内维持AAV突变体文库或在培养中的组织中培养病毒文库适合AAV突变体文库中的AAV载体在已经递送了AAV突变体文库的培养的组织或动物宿主的一种或多种组织内相互竞争的一段时间，并且/n(e)使用单细胞或单核微流体方法，从已经递送了AAV突变体文库的动物宿主的一种或多种组织内的细胞中创建单细胞或单核cDNA文库。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181228 US 62/785,8181.一种方法，其包括：
(a)创建AAV突变体或启动子的文库，其中文库内的每种AAV包含独特的DNA条码，或每种启动子构建体包含独特的DNA条码，
(b)利用双重(对于衣壳文库)或三重(对于启动子文库)转染方案将AAV突变体或启动子包装进包装细胞系中，
(c)将AAV突变体文库递送进动物宿主的一种或多种组织中，或感染培养中的组织，
(d)在体内维持AAV突变体文库或在培养中的组织中培养病毒文库适合AAV突变体文库中的AAV载体在已经递送了AAV突变体文库的培养的组织或动物宿主的一种或多种组织内相互竞争的一段时间，并且
(e)使用单细胞或单核微流体方法，从已经递送了AAV突变体文库的动物宿主的一种或多种组织内的细胞中创建单细胞或单核cDNA文库。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)使用单细胞微流体技术。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)使用单核微流体技术。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述动物宿主的一种或多种组织包括神经组织。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述神经组织包括中枢神经系统组织。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述中枢神经系统组织是脑组织。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述神经组织包括外周神经系统组织。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述动物宿主的一种或多种组织包括视网膜组织。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述动物宿主的一种或多种组织包括肌肉组织。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述肌肉组织包括横纹肌。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述肌肉组织包括心肌。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述肌肉组织包括平滑肌。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述动物宿主是灵长类。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述灵长类是旧世界猴。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述旧世界猴是恒河猴(Macacamulatta)。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述灵长类是长臂猿科或人科的猿。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述灵长类不是人属。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述灵长类不是黑猩猩属。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述AAV突变体文库的递送是通过注射进所述组织。
20.一种用于获得具有体内感染所需细胞类型和在所述的细胞类型内体内维持至少一周的能力的AAV突变体的方法，其中所述方法包括：
(a)将AAV突变体文库引入包含所述细胞类型的动物宿主，其中所述文库内的每种AAV包含独特的DNA条码，且
(b)基于存在于所述细胞类型的细胞中的针对一种或多种AAV突变体的所述条码，鉴定所述一种或多种AAV突变体，其中所述细胞在所述文库被引入所述动物宿主后在所述动物宿主内维持至少一周。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞类型是中枢神经系统细胞类型或外周神经系统细胞类型。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞类型是视网膜细胞类型、横纹肌细胞类型、心肌细胞类型或平滑肌细胞类型。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述动物宿主是灵长类...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·拜恩，W·R·斯涛弗尔，
申请(专利权)人：匹兹堡大学联邦系统高等教育，
类型：发明
国别省市：美国;US
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