一种短肽、检测试剂盒及检测血管内皮生长因子的方法技术

本发明专利技术公开了一种短肽、检测试剂盒及检测血管内皮生长因子的方法，短肽为多肽1或多肽2；所述多肽1为：由氨基酸序列为LSTSPHTGGGSC组成的多肽；所述多肽2为：将多肽1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的多肽。将该短肽作为捕获抗体，结合化学发光酶免疫分析技术(CLIA)检测血清中指定肿瘤标志物的方法。利用固相的生物多肽探针与待检测血清样本中的靶蛋白进行孵育，随后在催化显色体系下即可实现对其有效检测。本发明专利技术提供的方法特异性强、灵敏度高、操作便捷，同时探针制作纯化成本较为低廉，为实现VEGF165的灵敏、快速检测提供了一条有效途径。

【技术实现步骤摘要】
一种短肽、检测试剂盒及检测血管内皮生长因子的方法
本专利技术属于生物技术和免疫分析
，涉及一种短肽、检测试剂盒及检测血管内皮生长因子的方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。血管内皮生长因子(VEGF)是等电点为8.5、分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，由两个相同亚单位通过二硫键结合形成，具有很强的耐酸和耐热能力。VEGF是调节新血管生成的极为重要的细胞因子。VEGF有5种不同的亚型，分别为VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF145及VEGF121。其中，VEGF165是最有效的促血管生成同工型，它含有肝素和受体结合域。研究表明VEGF165在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用。肿瘤细胞的快速生长和转移需要氧气和营养物质的独立血液输送，这导致VEGF165的过表达。已有大量文献刊物报道，癌症患者血液中VEGF165浓度较正常人显著升高。因此，检测人血液中的VEGF165浓度，是用于癌症的早期普查诊断的有效手段。另一方面，VEGF165在人体血液中的浓度会随着肿瘤的消长情况而变化。肿瘤块较大、生长较快时，VEGF165在的血液的浓度就高；而当肿瘤通过化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。因此对VEGF165的检测可作为临床疗效观察和预后的重要指标。此外，血液VEGF水平增高亦常见于血管炎症性疾病、糖尿病、某些免疫性疾病以及妊娠等。r>迄今为止，已开发出多种测定VEGF165的方法，例如适配体传感器，电化学发光，荧光方法，石英晶体微量天平，表面等离振子共振，表面增强拉曼散射，电化学方法和酶联免疫吸附测定。在大多数情况下，抗原和识别元件(通常是抗体或适体)之间的特异性相互作用被用来捕获靶抗原。目前我国获准上市的临床检测VEGF165试剂盒检测原理以辣根过氧化物酶(HRP)联合鲁米诺类化合物化学发光法和酶联免疫法为主，用来捕获抗原的探针通常选用抗体或适配体等。经过本专利技术的专利技术人研究发现，尽管抗体和适配体作为捕获探针具有良好的选择性，但其固有的弱点(例如繁琐的制备过程，低稳定性和高成本)限制了它们的应用，此外，现有的检测方法不仅操作过程繁琐，自动化程度较低，且受人为因素的影响较大。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种短肽、检测试剂盒及检测血管内皮生长因子的方法，能够特异、灵敏、操作简便、快速检测血清VEGF165。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一方面，一种短肽，为多肽1或多肽2；所述多肽1为：由氨基酸序列为LSTSPHTGGGSC组成的多肽；所述多肽2为：将多肽1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的多肽。经过实验发现，该短肽对VEGF165不仅具有高亲和力和高选择性等优点，而且具有分子量小、稳定性好等优势。另一方面，一种检测试剂盒，包括上述短肽、多克隆一抗、与辣根过氧化物酶缀合的单克隆二抗，所述多克隆一抗为能够识别VEGF165并与VEGF165结合的多克隆抗体，所述单克隆二抗为能够识别多克隆一抗并与多克隆一抗结合的单克隆抗体。第三方面，一种上述短肽或检测试剂盒在检测血管内皮生长因子中的应用。第四方面，一种检测血管内皮生长因子的方法，提供上述短肽或检测试剂盒，将短肽固定，向固定短肽后的酶标板里加入含有VEGF165的待测溶液进行孵育，再加入多克隆一抗进行孵育，然后加入与过氧化氢酶缀合的单克隆二抗进行孵育，再添加鲁米诺发光剂和H2O2进行化学发光检测。本专利技术的有益效果为：本专利技术利用可特异性识别和结合血管内皮生长因子的多肽探针代替捕获抗体，并采用具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、操作简便等诸多优点的化学发光酶免疫分析，通过一系列流程的优化，构建出完善的检测体系，实现了对VEGF165的灵敏特异检测，极具现实意义。具体是：1)本专利技术提供的多肽对VEGF165具有高亲和力和高选择性；同时该多肽的分子量小、稳定性好、特异性强、成本较低，能够很好的替代检测体系中的固相捕获抗体。2)本专利技术方法VEGF165的检出限为5.7pg/mL，低于迄今报道的大多数方法的检出限。所提出的方法具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、操作简便、安全性好、商业化成本低等优点，通过对实际血清样品的检测证明该方法适用于对临床血清样品的检测，在医学免疫诊断和生物学研究等诸多领域开辟出一条有前景的检测方法。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例提供的合成探针V特异性测试结果。图2为本专利技术实施例提供的合成探针V最佳包被浓度测试结果。图3为本专利技术实施例提供的多克隆抗体最佳稀释比例的测试结果。图4为本专利技术实施例提供的检测VEGF165工作曲线。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。鉴于现有检测VEGF165的一抗存在制备过程繁琐、稳定性低、成本高等缺陷，本专利技术提出了一种短肽、检测试剂盒及检测血管内皮生长因子的方法。本专利技术的一种典型实施方式，提供了一种短肽，为多肽1或多肽2；所述多肽1为：由氨基酸序列为LSTSPHTGGGSC组成的多肽；所述多肽2为：将多肽1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的多肽。经过实验发现，该短肽对VEGF165不仅具有高亲和力和高选择性等优点，而且具有分子量小、稳定性好等优势。所述短肽为短链的多肽。该短肽在保证结合位点部分的同时进行了适度延长，以增强与聚苯乙烯表面的结合效率，同时有利于探针结合位点部位更充分的暴露。本专利技术的另一种实施方式，提供了一种检测试剂盒，包括上述短肽、多克隆一抗、与辣根过氧化物酶缀合的单克隆二抗，所述多克隆一抗为能够识别VEGF165并与VEGF165结合的多克隆抗体，所述单克隆二抗为能够识别多克隆一抗并与多克隆一抗结合的单克隆抗体。该实施方式的一种或多种实施例中，多克隆一抗为兔抗VEGF165多克隆抗体，单克隆二抗为山羊抗兔免疫球蛋白G单克隆抗体。本专利技术的第三种实施方式，提供了一种上述短肽或检测试剂盒在检测血管内皮生长因子中的应用。本专利技术优选的，所述应用以非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种短肽，其特征是，为多肽1或多肽2；/n所述多肽1为：由氨基酸序列为LSTSPHTGGGSC组成的多肽；/n所述多肽2为：将多肽1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种短肽，其特征是，为多肽1或多肽2；
所述多肽1为：由氨基酸序列为LSTSPHTGGGSC组成的多肽；
所述多肽2为：将多肽1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的多肽。


2.一种检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述的短肽、多克隆一抗、与辣根过氧化物酶缀合的单克隆二抗，所述多克隆一抗为能够识别VEGF165并与VEGF165结合的多克隆抗体，所述单克隆二抗为能够识别多克隆一抗并与多克隆一抗结合的单克隆抗体。


3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征是，多克隆一抗为兔抗VEGF165多克隆抗体，单克隆二抗为山羊抗兔免疫球蛋白G单克隆抗体。


4.一种权利要求1所述的短肽或权利要求2或3所述的检测试剂盒在检测血管内皮生长因子中的应用。


5.一种检测血管内皮生长因子的方法，其特征是，提供权利要求1所述的短肽或权利要求2或3所述的检测试剂盒，将短肽固定，向固定短肽后的酶标板中加入含有VEGF165的待测溶液进行孵育，再加入多克隆一抗进行孵育，然后加入与辣...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱骅，王戈，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37