一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法技术

本发明专利技术属于生物基因技术领域，公开了一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，引物设计与合成；重组质粒的构建；EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；EPF重组蛋白表达条件优化；多克隆抗体的制备及鉴定。本发明专利技术通过原核表达系统，表达并纯化牦牛早孕因子(Early pregnancy factor，EPF)重组蛋白，用纯化后蛋白免疫小鼠诱导其产生EPF多克隆抗体。实验结果表明，本发明专利技术成功构建了牦牛早孕因子重组质粒，通过原核表达系统表达了EPF蛋白，用重组EPF蛋白免疫小鼠，得到了牦牛早孕因子多克隆抗体，该抗体具有免疫原性。

【技术实现步骤摘要】
一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法
本专利技术属于生物基因
，尤其涉及一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法。
技术介绍
目前，早孕因子已被鉴定为热休克蛋白10(Hsp10)的细胞外同源物，位于妊娠期间细胞外，在妊娠第一阶段释放来参与妊娠的成功建立。在正常生理条件下，EPF只在怀孕期间被发现，可能是妊娠期间接促进胚胎发育的重要因素。所有妊娠期的生殖组织如：卵巢，输卵管，胎盘都显示有EPF的特异性表达。EPF由两个亚单位组成，分别叫做EPF-A和EPFB，它们有不同的合成位点。EPF-A是在发情和怀孕期间在输卵管内合成的，在输卵管中，EPF在纤毛分泌上皮细胞和纤毛细胞的纤毛中表达。EPFB只与怀孕有关，在着床前由卵巢产生，在卵巢中的表达以卵泡型叶黄素细胞为主，其功能是作为一种黄体营养因子；在着床后由胚胎产生，在胎盘中的中胚层绒毛膜尿囊和内胚层上皮表达。实验数据表明，EPFB是成功怀孕的重要因素，它既可作为生长因子，也可以作为一种促进母体免疫系统对异体胎儿耐受的免疫抑制剂，充当着床期滋养细胞的自分泌和旁分泌生长因子，诱导免疫细胞如CD4+，CD25+调节性T细胞的分化并增强他们的免疫抑制活性，这可能是母体怀孕期间抑制免疫应答的重要机制。EPF作为细胞因子平衡中的一个重要调节因子，确保一个合适的免疫环境来进行妊娠，也可以保护受精卵一直到胎盘形成，并能够产生高密度脂蛋白以维持这种抑制的免疫状态。因此，EPF被认为是直接或间接参与导致成功妊娠的复杂相互作用的重要分子。牦牛是生活在高原地区的一种非常独特的畜种，它从生理生化及结构上都稳定的遗传了高原地区动物的低氧适应能力。即便如此，牦牛的繁殖活动也受到高原低氧恶劣环境的影响，为了适应这种影响牦牛自身获得繁衍对策模式-季节性繁殖。然而由于牦牛的粗放管理，配种时间难掌握，早期妊娠诊断滞后等原因，使牦牛出现繁殖率低，生产效益差的劣势。因此，具备一项能通过更简便的方法在牦牛怀孕早期就可确诊的妊娠诊断技术是牦牛产业高效发展的迫切要求。同时，现有技术中关于早孕因子原核表达、重组蛋白纯化的多克隆抗体制备的技术方案尚未见报道。因此，亟需一种关于早孕因子原核表达、重组蛋白纯化的多克隆抗体制备的相关技术方案。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)由于牦牛的粗放管理，配种时间难掌握，早期妊娠诊断滞后等原因，使牦牛出现繁殖率低，生产效益差的劣势。(2)现有技术中关于早孕因子原核表达、重组蛋白纯化及多克隆抗体制备的技术方案尚未见报道。解决以上问题及缺陷的难度为：本实验中需要采取妊娠期牦牛胎盘及卵巢组织，以及孕期牦牛的血清，由于牦牛妊检方式的滞后，较难判断牦牛是否属于妊娠期，所以采样会有一定难度。由于实验室仪器设备有限，在实验进行过程中会有些困难。解决以上问题及缺陷的意义为：在牦牛养殖业中，目前为止妊娠诊断技术研究依然比较滞后。早孕因子(EPF)作为超早孕诊断指标，其准确率可达88％。因此，本项目通过制备EPF抗体，希望可以建立一种可快速准确检测牦牛早孕的方法。期待这种较为理想的早期妊娠诊断方法应用于牦牛产业中，促进牦牛产业的发展。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，尤其涉及一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法。本专利技术是这样实现的，一种多克隆抗体在制备用于检测畜类怀孕早期药物上的应用。一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法包括以下步骤：步骤一，引物设计与合成；步骤二，重组质粒的构建；步骤三，EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；步骤四，EPF重组蛋白表达条件优化；步骤五，多克隆抗体的制备及鉴定。进一步，步骤一中，所述引物设计与合成，包括：利用软件Primepremier5设计引物，两端选择Sac1和Xho1酶切位点，引物大小为309bp。进一步，步骤一中，所述引物序列如SEQIDNO：1所示。进一步，步骤二中，所述重组质粒的构建，包括：(1)目的基因扩增使用Trizol法从牦牛胎盘组织中提取RNA后按反转录试剂盒步骤反转录为cDAN，以cDAN为扩增模板扩增EPF目的基因；(2)重组质粒构建使用DNA凝胶回收试剂盒对扩增出的EPF基因回收，并将该目的产物和载体pET28-His10-Sumo分别用SacI内切酶和XhoI内切酶于37℃水浴酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收；将回收后的目的产物，空载体，T4DNA连接酶体系用封口膜封口于16℃连接过夜；连接产物转化至DH5α感受态细胞中：将4ul产物加入50ul感受态中冰浴30min，42℃热激90s，迅速放入碎冰冰浴2min，加入400ulLB于37℃摇床培养1h，取50ul涂在含卡那的LB固体培养基上，37℃过夜倒置培养；使用QIAprepSpinMiniprepKit50提质粒，并进行重组质粒菌液PCR鉴定和测序验证。进一步，步骤(1)中，总体系为25ul：上下游引物各1ul，模板1ul，1-5TM2XHigh-FidelityMasterMix12.5ul，用高压后的去离子水补至25ul；PCR反应程序为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火55℃，15s，延伸72℃，30s，循环数为34，重延伸72℃，5min，4℃保存。进一步，步骤(2)中，酶切体系为：10XCutSmartBuffer4ul，SacI和XhoI各1ul，目的产物/载体8ul，26ul的dd水；连接体系为：10XT4DNAligaseBuffer1ul，T4DNAligase1ul，目的片段6ul，载体2ul。进一步，步骤三中，所述EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定，包括：将阳性质粒转化至BL21即DE3感受态细胞中；涂板培养后挑取单克隆于37℃震荡培养13～16h收集于4℃冰箱保存备用；将保存的EPF重组菌液按1：200接种于37℃震荡培养，2～3h后加入IPTG过夜诱导，次日收集菌液，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理后取部分菌液进行SDS-PAGE电泳；剩余菌液离心，分别收集上清和包涵体进行WesternBlot实验。进一步，步骤四中，所述EPF重组蛋白表达条件优化，包括：(1)诱导剂浓度优化将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h后分别加入0nmol/L、100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L、500nmol/L、700nmol/L、900nmol/LIPTG在37℃下过夜诱导，次日各取1ml菌液制备蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定最佳诱导剂浓度；(2)诱导温度优化将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h后加入300nmol/LIPTG分别放在16℃、26℃、30℃、37℃过夜诱导，次本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多克隆抗体在制备用于检测畜类怀孕早期药物上的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种多克隆抗体在制备用于检测畜类怀孕早期药物上的应用。


2.一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，引物设计与合成；
步骤二，重组质粒的构建；
步骤三，EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；
步骤四，EPF重组蛋白表达条件优化；
步骤五，多克隆抗体的制备及鉴定。


3.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述引物设计与合成，包括：
利用软件Primepremier5设计引物，两端选择Sac1和Xho1酶切位点，引物大小为309bp；
所述引物序列如SEQIDNO：1所示。


4.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述重组质粒的构建，包括：
(1)目的基因扩增
使用Trizol法从牦牛胎盘组织中提取RNA后按反转录试剂盒步骤反转录为cDAN，以cDAN为扩增模板扩增EPF目的基因；
(2)重组质粒构建
使用DNA凝胶回收试剂盒对扩增出的EPF基因回收，并将该目的产物和载体pET28-His10-Sumo分别用SacI内切酶和XhoI内切酶于37℃水浴酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收；将回收后的目的产物，空载体，T4DNA连接酶体系用封口膜封口于16℃连接过夜；连接产物转化至DH5α感受态细胞中：将4ul产物加入50ul感受态中冰浴30min，42℃热激90s，迅速放入碎冰冰浴2min，加入400ulLB于37℃摇床培养1h，取50ul涂在含卡那的LB固体培养基上，37℃过夜倒置培养；使用QIAprepSpinMiniprepKit50提质粒，并进行重组质粒菌液PCR鉴定和测序验证。


5.如权利要求4所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，总体系为25ul：上下游引物各1ul，模板1ul，1-5TM2XHigh-FidelityMasterMix12.5ul，用高压后的去离子水补至25ul；
PCR反应程序为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火55℃，15s，延伸72℃，30s，循环数为34，重延伸72℃，5min，4℃保存。


6.如权利要求4所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切体系为：10XCutSmartBuffer4ul，SacI和XhoI各1ul，目的产物/载体8ul，26ul的dd水；
连接体系为：10XT4DNAligaseBuffer1ul，T4DNAligase1ul，目的片段6ul，载体2ul。


7.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述EPF重组蛋白的表达及表达形...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊江峰，曹艳桃，余四九，陈豪泰，徐庚全，潘阳阳，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62