Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统技术方案

本发明专利技术公开了一种Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统，以双元表达载体GPiE‑egfp为基础，用优化的Cas9蛋白编码基因替换双元表达载体GPiE‑egfp的eGFP编码基因获得Cas9蛋白双元表达载体。其具有能够在大肠杆菌和农杆菌中复制扩增的元件、能够携带外源基因的LB T‑DNA和RB T‑DNA、灵芝中组成型表达基因gpd的启动子Glgpdp和优化的Cas9蛋白编码基因，所述优化的cas9基因的N端包含Glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列共76个碱基和3×FLAG标签，同时在cas9基因的N端和C端各增加一个核定位信号编码序列NLS。本发明专利技术经密码子优化Cas9蛋白双元表达载体适合在丝状真菌香菇中表达Cas9蛋白。

【技术实现步骤摘要】
Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统
本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种可以在高等丝状真菌香菇中过表达Cas9蛋白的Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统。
技术介绍
CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)系统是继ZNF和TALENS技术之后的第三代基因编辑技术，被广泛应用于原核生物以及真核生物细胞水平和个体水平基因编辑细胞系。CRISPR/Cas9相比其他基因编辑技术，如新指核酸酶(ZFNs)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，操作更简单，同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑，该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全，毒性更低的新方法。到目前为止CRISPR/Cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等，从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变。另一方面，其强大的基因组编辑能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Cas9蛋白双元表达载体，以双元表达载体GPiE-egfp为基础，其特征在于，用优化的Cas9蛋白编码基因替换双元表达载体GPiE-egfp的eGFP编码基因获得的GPiE-cas9双元表达载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种Cas9蛋白双元表达载体，以双元表达载体GPiE-egfp为基础，其特征在于，用优化的Cas9蛋白编码基因替换双元表达载体GPiE-egfp的eGFP编码基因获得的GPiE-cas9双元表达载体。


2.根据权利要求1所述的Cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述优化的Cas9蛋白编码基因包括：
所述Cas9蛋白编码基因的N端包含Glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列；
所述Cas9蛋白编目基因C端包含一个35S终止子。


3.根据权利要求2所述的Cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述Cas9蛋白编码基因的N端包含Glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列，共76个碱基，如SEQIDNo.2所示。


4.根据权利要求2所述的Cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述Cas9蛋白编目基因C端包含一个35S终止子，如SEQIDNo.6。


5.根据权利要求2所述的Cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述优化的Cas9蛋白编码基因还包括：
所述Cas9蛋白编码基因N端增加如SEQIDNo.3所示的3×FLAG标签序列，以利于后续检测蛋白质表达；
和/或，
所述Cas9蛋白编码基因N端和C端各增加一个如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示的核定位信号编码序列NLS，增加cas9基因的核定位能力。


6.根据权利要求2所述的Cas9蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：付阳，谭琦，尚晓冬，宋春艳，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31