用于增加蛋白质表达和/或治疗单倍剂量不足症的方法及组合物技术

与非最佳密码子杂交的tRNA可用于增加哺乳动物细胞中由含有非最佳密码子的基因所编码的基因产物的表达，或用于治疗受试者的具有包含非最佳密码子的单倍剂量不足基因的单倍剂量不足症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增加蛋白质表达和/或治疗单倍剂量不足症的方法及组合物优先权声明本申请要求2018年9月26日提交的、序列号为62/736,847的美国临时专利申请的优先权，并通过引用将其全部内容合并与此。
本公开内容总体上涉及在受试者中增加由包含非最佳密码子的基因所编码的基因产物的表达和/或治疗受试者单倍剂量不足症的方法及组合物。
技术介绍
当一个等位基因失活，并且由剩余的活性等位基因表达的基因产物量不足以维持正常的基因功能时，就发生单倍剂量不足(haploinsufficiency)。许多疾病与单倍体不足相关，或由单倍剂量不足引起。单倍剂量不足症的一个例子是Dravet综合征。Dravet综合征是一种罕见的灾难性顽固性癫痫，始于婴儿期。最初，患者会经历长时间的癫痫发作。第二年，其他类型的癫痫发作开始发生，这通常与发育衰退同时发生，可能是由于反复的大脑缺氧所致。这导致语言和运动机能发育不良。Dravet综合征与SCN1A(编码电压门控钠通道α亚基)、SCN1B(编码电压门控钠通道β1亚基)、SCN2A、SCN3A、SCN9A、GABRG2(编码γ-氨基丁酸受体γ2亚基)、GABRD(编码γ-氨基丁酸受体δ亚基)和/或PCDH19基因的突变相关。例如，Dravet综合征可能由SCN1A基因突变引起，该SCN1A基因突变导致一个SCN1A基因等位基因失活以及功能性SCN1A基因产物缺乏或数量减少。SCN1A基因通常编码神经元电压门控钠离子通道α亚基Na(V)1.1。在小鼠模型中，已观察到SCN1A的功能丧失型突变导致钠电流减少和海马GABA能中间神经元兴奋性受损。因此，本领域需要一种增加蛋白质表达和治疗单倍剂量不足症的改进的组合物及方法，所述单倍剂量不足症包括Dravet综合征。
技术实现思路
本公开总体上涉及增加受试者基因产物的表达和/或治疗受试者单倍剂量不足症的方法及组合物，所述基因产物由包含非最佳密码子的基因进行编码。目的基因中非最佳密码子的存在会导致从该基因转录的mRNA的不稳定，从而影响该基因所编码的功能蛋白的产生。在这种情况下，例如，当与非最佳密码子杂交的特定氨酰化tRNA分子的丰度低于细胞中用相同氨基酸氨酰化的其他不同tRNA时，就会发生mRNA转录物的不稳定。令人惊讶的是，已经发现，相对于其他天然丰度更高的tRNA，增加细胞中这种tRNA的丰度可以促进细胞产生的功能蛋白的表达和/或数量。通过将解码基因中非最佳密码子的极少数(如1、2或3个)tRNA导入细胞，可增加和/或选择性增加基因产物(如蛋白质)的表达(即，该基因产物的表达可以比另一种基因产物或其他任何基因产物增加更多)。类似地，对于具有包含非最佳密码子基因的受试者，向受试者施用有效量的解码非最佳密码子的tRNA可以增加受试者中来自该基因的基因产物的表达。因此，向受试者施用tRNA可以治疗受试者中由基因产物表达不足引起的疾病，例如，单倍剂量不足症。此外，本文描述的方法及组合物的特征使得它们适合治疗人类受试者的疾病，如单倍剂量不足症。例如，tRNA的大小相对较小，并且可以重组产生，并且本文所述的方法及组合物可以治疗单倍剂量不足症，而无论是突变或是等位基因失活的机制。因此，一方面，本公开提供了一种增加哺乳动物细胞中由含有第一非最佳密码子的基因所编码的基因产物的表达的方法。所述方法包括向细胞中导入有效量的第一外源性tRNA，所述第一外源性tRNA：(i)包含与第一非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第一外源性tRNA的类似细胞，将第一外源性tRNA导入细胞增加了基因产物的表达。在某些实施方案中，所述基因包含第二非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的第二外源性tRNA导入细胞，所述第二外源性tRNA：(i)包含与第二非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第二外源性tRNA的类似细胞，将第二外源性tRNA导入细胞增加了基因产物的表达。在某些实施方案中，所述基因包含第三非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的第三外源性tRNA导入细胞，所述第三外源性tRNA：(i)包含与第三非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够用氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第三外源性tRNA的类似细胞，将第三外源性tRNA导入细胞增加了基因产物的表达。另一方面，本公开提供了一种增加哺乳动物细胞中由含有第一非最佳密码子的基因所编码的基因产物的表达的方法。所述方法包括向细胞中导入有效量的能够表达第一外源性tRNA的第一表达载体，所述第一外源性tRNA：(i)包含与第一非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第一外源性tRNA的类似细胞，第一外源性tRNA在细胞中的表达增加了基因产物的表达。在某些实施方案中，所述基因包含第二非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的能够表达第二外源性tRNA的第二表达载体导入细胞，所述第二外源性tRNA：(i)包含与第二非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第二外源性tRNA的类似细胞，第二外源性tRNA在细胞中的表达增加了基因产物的表达。在某些实施方案中，所述基因包含第三非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的能够表达第三外源性tRNA的第三表达载体导入细胞，所述第三外源性tRNA：(i)包含与第三非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第三外源性tRNA的类似细胞，第三外源性tRNA在细胞中的表达增加了基因产物的表达。在某些实施方案中，第一表达载体、第二表达载体和/或第三表达载体是相同的。在某些实施方案中，第一表达载体、第二表达载体和/或第三表达载体是病毒载体，例如，腺相关病毒(AAV)载体。在前述增加表达的任何方法的实施方案中，所述细胞是人类细胞。在某些实施方案中，所述细胞是中枢神经系统细胞，例如，神经元。在某些实施方案中，所述基因选自AGGF1、ARHGAP31、BMPR2、CHD7、COL2A1、COL3A1、CTLA4、CTNNB1、DLL4、EHMT1、ELN、ENG、FAS、FBN1、FOXG1、GATA3、GLI3、GRN、IRF6、JAG1、KCNQ4、LMX1B、MBD5、MED13L、MITF、MNX1、MYCN、NFIA、NFIX、NOTCH1、NSD1、PAX3、PHIP、PRKAR1A、RAI1、RBPJ、RPS14、RUNX2、SALL4、SCN1A、SETBP1、SHANK3、SHH、SHOX、SLC2A1/GLUT1、SOX10、SYNGAP1、TBX1、TBX3、TBX5、TCF4、TCOF1、TGIF1、TNXB、TRPS1、WT1和ZIC2。在某些实施方案中，所述基因是SCN1A。另一方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的单倍剂量不足症的方法，其中所述受试者具有包含第一非最佳密码子的单倍剂量不足基因。所述方法包括向受试者施用有效量的第一tRNA，所述第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.增加哺乳动物细胞中由含有第一非最佳密码子的基因所编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括向细胞中导入有效量的第一外源性tRNA，所述第一外源性tRNA：(i)包含与第一非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第一外源性tRNA的类似细胞，将第一外源性tRNA导入细胞增加了基因产物的表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180926 US 62/736,8471.增加哺乳动物细胞中由含有第一非最佳密码子的基因所编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括向细胞中导入有效量的第一外源性tRNA，所述第一外源性tRNA：(i)包含与第一非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第一外源性tRNA的类似细胞，将第一外源性tRNA导入细胞增加了基因产物的表达。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因包含第二非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的第二外源性tRNA导入细胞，所述第二外源性tRNA：(i)包含与第二非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第二外源性tRNA的类似细胞，将第二外源性tRNA导入细胞增加了基因产物的表达。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因包含第三非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的第三外源性tRNA导入细胞，所述第三外源性tRNA：(i)包含与第三非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够用氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第三外源性tRNA的类似细胞，将第三外源性tRNA导入细胞增加了基因产物的表达。


4.增加哺乳动物细胞中由含有第一非最佳密码子的基因所编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括向细胞中导入有效量的能够表达第一外源性tRNA的第一表达载体，所述第一外源性tRNA：(i)包含与第一非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第一外源性tRNA的类似细胞，第一外源性tRNA在细胞中的表达增加了基因产物的表达。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述基因包含第二非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的能够表达第二外源性tRNA的第二表达载体导入细胞，所述第二外源性tRNA：(i)包含与第二非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第二外源性tRNA的类似细胞，第二外源性tRNA在细胞中的表达增加了基因产物的表达。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述基因包含第三非最佳密码子，并且所述方法还包括将有效量的能够表达第三外源性tRNA的第三表达载体导入细胞，所述第三外源性tRNA：(i)包含与第三非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，其中，相对于缺乏第三外源性tRNA的类似细胞，第三外源性tRNA在细胞中的表达增加了基因产物的表达。


7.根据权利要求5或6所述的方法，其中第一、第二和/或第三表达载体是相同的。


8.根据权利要求4～7中任一项所述的方法，其中第一、第二和/或第三表达载体是病毒载体。


9.根据权利要求8所述的方法，其中第一、第二和/或第三表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。


10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。


11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中所述基因选自AGGF1、ARHGAP31、BMPR2、CHD7、COL2A1、COL3A1、CTLA4、CTNNB1、DLL4、EHMT1、ELN、ENG、FAS、FBN1、FOXG1、GATA3、GLI3、GRN、IRF6、JAG1、KCNQ4、LMX1B、MBD5、MED13L、MITF、MNX1、MYCN、NFIA、NFIX、NOTCH1、NSD1、PAX3、PHIP、PRKAR1A、RAI1、RBPJ、RPS14、RUNX2、SALL4、SCN1A、SETBP1、SHANK3、SHH、SHOX、SLC2A1/GLUT1、SOX10、SYNGAP1、TBX1、TBX3、TBX5、TCF4、TCOF1、TGIF1、TNXB、TRPS1、WT1和ZIC2。


12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中所述基因是SCN1A。


13.治疗有需要的受试者的单倍剂量不足症的方法，其中所述受试者具有包含第一非最佳密码子的单倍剂量不足基因，所述方法包括向受试者施用有效量的第一tRNA，所述第一tRNA：(i)包含与第一非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，从而治疗受试者的单倍剂量不足症。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述单倍剂量不足基因包含第二非最佳密码子，并且所述方法还包括向受试者施用有效量的第二tRNA，所述第二tRNA：(i)包含与第二非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化。


15.根据权利要求14所述的方法，其中所述单倍剂量不足基因包含第三非最佳密码子，并且所述方法还包括向受试者施用有效量的第三tRNA，所述第三tRNA：(i)包含与第三非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化。


16.治疗有需要的受试者的单倍剂量不足症的方法，其中所述受试者具有包含第一非最佳密码子的单倍剂量不足基因，所述方法包括向受试者施用有效量的能够表达第一tRNA的第一表达载体，所述第一tRNA：(i)包含与第一非最佳密码子杂交的反密码子，(ii)能够被氨基酸氨酰化，从而治疗受试者的单倍剂量不足症。

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【专利技术属性】
技术研发人员：杰弗里·M·科莱尔，托马斯·斯威特，哈维·洛迪什，
申请(专利权)人：卡斯西部储备大学，怀特黑德生物医学研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US