一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法技术

本发明专利技术提供了一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，包括以下步骤：1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离；2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上；3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上；4)采用拉曼光谱分析，根据纳米标签的拉曼特征峰强度计算出每一种蛋白质的浓度。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术的蛋白质电泳技术、SERS和有序结构光子晶体膜相结合，构建一种新的单细胞蛋白质定量分析方法，能够同时满足高灵敏和宽线性定量检测要求。

【技术实现步骤摘要】
一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法
本专利技术涉及单细胞蛋白组学
，尤其涉及一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法。
技术介绍
随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究进入了后基因组时代。功能基因组学成为生命科学研究的焦点，其主要包括结构基因组研究和蛋白质组研究。尽管基因组学在基因活性和疾病相关方面提供了有力而直接的依据，但基因的表达方式错综复杂。在不同的条件或不同的时期下，同一个基因经过复制、转录和翻译之后，可能会表达出功能完全不同的蛋白质。因此，研究生命现象，仅仅了解掌握基因组的结构是远远不够的，还需对生命活动的直接执行者——蛋白质进行更深入的研究。一直以来，生命科学的研究主要基于群体细胞水平的分析。而细胞作为生物体基本的结构和功能单位，分析单细胞水平的蛋白表达对解析生命体的活动规律具有重大的意义。但是对单细胞的分析是一个极具挑战性的问题，原因在于单细胞的尺寸在几个微米到几百个微米，且内部结构十分精密；同时，单细胞研究也被列为Science杂志2013年六大重点科学研究之首。近几年涌现的单细胞组学技术主要针对的是细胞DNA或RNA的测序；同时面临着测试成本高和精度低困境。现有的单细胞蛋白分析研究方法主要包括质谱、流式细胞仪和免疫组化。其中质谱是蛋白质定量分析比较常见且最精准的方法。但其通常需要对样品进行较复杂的前处理过程，且不能对蛋白质组进行成像。此外，质谱仪比较昂贵，并不利于推广使用。流式细胞仪和免疫组化一般需要对蛋白进行放射性同位素或者荧光标记，在应用上也有一定的局限性。目前，WesternBlotting(WB)一般需要将分离的蛋白质组分转印到硝酸纤维素膜上，然后进行化学发光或者荧光显色检测。现有的商品化单细胞WB分析仪器Milo系统采用的是底物荧光显色。荧光显色的缺点主要在于荧光分子的光化学稳定性比较差，荧光信号容易漂白和淬灭，难以保证检测结果的准确性；此外，荧光检测的灵敏度并不是很高；另外一方面，由于硝酸纤维素膜微观结构为无序多孔结构，孔的大小在微米左右，因此,膜对光的散射较强，整个膜呈现出白色，光的透过率较差，散射性较强，对光学检测灵敏度造成一定影响，在一定程度上也限制了灵敏度的提高。近年来，等离激元光子学和纳米技术发展迅速，它们在生物学、物理学、医疗诊断、环境监测、食品安全等方面崭露头角。尤其是通过合理设计表面增强拉曼散射的增强基底，可以实现单分子检测。光子晶体是由不同折射率的介质周期性排列而成的有序人工微结构，具有光子带隙特性以及光子局域特性，可以控制特定频率的光在其中的传播，从而增强光与物质的相互作用。将SERS与有序微纳结构相结合具有以下三点优势：一、有序结构的光子晶体膜可以避免现有商品化NC膜的光散射而带来的膜泛白影响；二、SERS纳米标签与有序结构的光子晶体膜结合，可以进一步增强标签的信号强度，从而降低检测限，这对于低丰度的蛋白检测是具有重大的意义；三、有序结构的光子晶体膜具有较大的比表面积，可以有效地拓宽线性检测范围。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，该方法使用SERS纳米标签作为显影剂，实现蛋白质的成像和定量检测，同时使用有序结构的光子晶体膜作为转印膜，可以增强纳米标签的拉曼信号，进一步提高检测的灵敏度，实现单细胞痕量蛋白质的检测，该电泳技术属于单细胞蛋白组学领域，其为高灵敏度和宽线性定量范围的单细胞WB提供了新的解决方案。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，包括以下步骤：1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离；2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上；3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上；4)采用拉曼光谱分析，根据纳米标签的拉曼特征峰强度计算出每一种蛋白质的浓度。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤1)中的微孔阵列芯片的制备步骤如下：①光刻胶均匀地旋涂于硅片或铜片或钢片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；②通过光刻刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板；③在模板上覆盖玻璃片或塑料片，使用注射器或滴管或移液器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤②中所使用的光刻可以是紫外光刻、电子束光刻、离子束光刻、X射线光刻、纳米压印光刻或激光刻蚀的一种。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤②中的微柱阵列的圆柱的高度为1μm～120μm，直径为1μm～100μm；模板的长度为1mm～5cm，宽度为500μm～4.5cm。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤③中所使用的玻璃片是石英玻璃片、钢化玻璃片或硼酸盐玻璃片的一种。塑料片是聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料的一种。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤2)中的反蛋白石结构光子晶体膜的制备步骤如下：I)将单分散胶体粒子通过垂直沉积或静电自组装的方式在硅片或玻璃片上形成光子晶体薄膜，并将此薄膜作为反蛋白石结构光子晶体膜的制作模板；II)将硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯溶液灌注到模板中，并加热固化；III)通过氢氟酸、二甲基甲酰胺或四氢呋喃的浸泡，或加热的方式，将模板粒子去除，得到反蛋白石结构光子晶体膜。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤I)中的单分散胶体粒子为聚苯乙烯、多孔硅、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚乙烯、二氧化硅或二氧化钛的一种；所述步骤I)中的单分散胶体粒子直径为50nm～10μm，所述的单分散胶体纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的浓度为10wt％～90wt％。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤II)中的硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯溶液的浓度为3％～50％；固化的温度范围在40℃～80℃。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤III)中的反蛋白石结构光子晶体膜的长度为1mm～5cm，宽度为500μm～4.5cm。作为本专利技术提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤3)中的SERS纳米标签显影剂有三部分组成；第一部分是信号标签；第二部分是增强信号标签的纳米材料；第三部分是检测抗体。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离；/n2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上；/n3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上；/n4)采用拉曼光谱分析，根据纳米标签的拉曼特征峰强度计算出每一种蛋白质的浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离；
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上；
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上；
4)采用拉曼光谱分析，根据纳米标签的拉曼特征峰强度计算出每一种蛋白质的浓度。


2.根据权利要求1所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤1)中的微孔阵列芯片的制备步骤如下：
①光刻胶均匀地旋涂于硅片或铜片或钢片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过光刻刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板；
③在模板上覆盖玻璃片或塑料片，使用注射器或滴管或移液器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。


3.根据权利要求2所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤②中所使用的光刻可以是紫外光刻、电子束光刻、离子束光刻、X射线光刻、纳米压印光刻或激光刻蚀的一种。


4.根据权利要求2所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤②中的微柱阵列的圆柱的高度为1μm～120μm，直径为1μm～100μm；模板的长度为1mm～5cm，宽度为500μm～4.5cm。


5.根据权利要求2所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤③中所使用的玻璃片是石英玻璃片、钢化玻璃片或硼酸盐玻璃片的一种。塑料片是聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料的一种。


6.根据权利要求1所述的基于电泳技术的单细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兵，孙斐，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32