检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法。检测鰤鱼诺卡氏菌的引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。本发明专利技术解决了现有的鰤鱼诺卡氏菌检测技术周期长、检测成本高、不能应用于现场快速检测等问题。本发明专利技术提供的引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。

【技术实现步骤摘要】
检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及微生物检测领域，更具体地，涉及检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
鰤鱼诺卡氏菌在分类上属于厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌目(Actinobacterales)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia)。是水产养殖业中一种主要的致病菌，感染后使得鱼体表及内脏形成大量结节，还会引起鱼类体表出血及溃疡，严重影响成鱼的品质。鰤鱼诺卡氏菌自然感染发病率可达到15～30％，严重时可达50～60％，平均死亡率约20％。据不完全统计，染病的鱼种有近20种，包括卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)、乌鳢(Channamaculata)、大口黑鲈(Micropterussalmoides)等经济鱼类，给水产养殖业造成了较大的经济损失。以往对鰤鱼诺卡氏菌的检测，多采用传统的细菌分离培养法，由于诺卡氏菌的生长周期长，耗时太久，准确性欠佳，养殖生产中亟需一种可以操作简便的鰤鱼诺卡氏菌快速有效的检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法。本专利技术提供了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。本专利技术还提供了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，该试剂盒包括上述引物。本专利技术还提供了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，包括：提取待检测样品基因组DNA；构建包括以下引物的反应体系：上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示；进行37℃恒温扩增反应；通过凝胶电泳来确定是否存在鰤鱼诺卡氏菌。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术针对鰤鱼诺卡氏菌设计特异性引物，建立了鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，可对鰤鱼诺卡氏菌进行定性检测。(2)本专利技术针对鰤鱼诺卡氏菌仅用一对引物即可完成扩增，省去了LAMP等其它恒温扩增方法需要的多对引物的复杂设计过程；本专利技术的引物扩增只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需30min，检测时间短；不像LAMP产物的弥散带，本申请的RAA扩增产物具有特定大小的条带，其结果易于判断。(3)本专利技术的RAA扩增引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。(4)本专利技术建立的鰤鱼诺卡氏菌RAA检测方法，灵敏、准确、简便和快速，对基层单位和养殖场快速检测鰤鱼诺卡氏菌具有指导意义。附图说明图1是采用本专利技术的RAA引物对鰤鱼诺卡氏菌和其他对照菌株进行特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有10条泳道：其中M:markerDL2000；1:鰤鱼诺卡氏菌NSX1株的RAA扩增产物；2:杀鲑诺卡氏菌的RAA扩增产物；3:褐色诺卡氏菌的RAA扩增产物；4:星状诺卡氏菌的RAA扩增产物；5:黄粉色诺卡氏菌的RAA扩增产物；6:绛红色诺卡氏菌的RAA扩增产物；7:紫褐诺卡氏菌的RAA扩增产物；8:河流诺卡氏菌的RAA扩增产物；N为阴性对照。图2是采用本专利技术的RAA引物对鰤鱼诺卡氏菌进行灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有七条泳道：其中M:markerDL2000，N：阴性对照；1-5分别为鰤鱼诺卡氏菌靶基因的不同浓度的克隆质粒的扩增产物(1:100ng/μL；2:10ng/μL；3:1ng/μL；4:100pg/μL；5:10pg/μL)。具体实施方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。通过在37℃恒温下，利用重组酶与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在0.5h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。相比于PCR、LAMP、qPCR等检测方法，方法更简单，对实验设备要求低，能够满足基层单位对鰤鱼诺卡氏菌快速检测的需求。本申请提供了一种鰤鱼诺卡氏菌快速检测引物，是由上游引物和下游引物组成，上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.1：5’-GGTTACGCCTCGCCCTACCCGTCCATCA-3’；SEQIDNO.2：5’-CCCGGTGTCCCAGTTGACCATGATCTCCC-3’。本申请还提供了一种用于鰤鱼诺卡氏菌快速检测的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品DNA(2)进行重组酶介导扩增(RAA扩增)以鰤鱼诺卡氏菌的DNA为模板，采用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物进行RAA扩增，得到RAA扩增产物，RAA扩增反应条件：将上述RAA扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴上反应30min，得到RAA扩增产物；所述的RAA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、浓度均为10μmol/L的上、下游引物各2μL，DNA模板2μL，最后再加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL。(3)RAA扩增产物的电泳检测向上述RAA扩增产物中加入50μL由苯酚和氯仿按体积比1:1混合而成的溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，若RAA扩增得到的扩增产物含有大小为250bp的片段，则进一步对RAA扩增产物进行测序验证。具体地，本专利技术的恒温快速检测鰤鱼诺卡氏菌的方法包括以下步骤：(1)提取DNA利用湖南艾科瑞生物工程有限公司的核酸提取试剂盒(SteadyPureBacterialGenomicDNAExtractionKit，AG21007)提取鰤鱼诺卡氏菌的基因组DNA。(2)引物设计通过分析鰤鱼诺卡氏菌的基因组序列，我们选择NOGM004001基因片段作为靶序列，设计鰤鱼诺卡氏菌的RAA检测的特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。(3)特异性检测实验利用所提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA为模板，其他菌株的DNA为对照，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为特异性引物，通过杭州众测生物科技有限公司购买的基础型核酸扩增试剂盒(S001ZC)构建RAA扩增体系：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入试剂盒中的再水化缓冲液41.5μL、浓度均为10μmol/L的上、下游引物各2μL，DNA模板2μL，最后再加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL,利用振荡器将反应液混合均匀。将以上反应体系放至金属本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测鰤鱼诺卡氏菌的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测鰤鱼诺卡氏菌的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。


2.一种检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的引物。

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【专利技术属性】
技术研发人员：夏洪丽，莫静怡，夏立群，鲁义善，樊慧敏，龙梦，汪志文，喻大鹏，陈文捷，
申请(专利权)人：广东海洋大学，广东海洋大学深圳研究院，深圳义海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44