本发明专利技术公开了一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术本发明专利技术提供了一种来源于Bacteroides nordii诺迪拟杆菌的肝素酶I BnHepI；来源于Bacteroides finetgoldii细沟拟杆菌的肝素酶I BfHepI，具有很好的热稳定性，其中，本发明专利技术中发现BnHepI的最适反应pH为8，最适反应温度为40℃；该酶具有较高的酶活，在最适条件下的最高酶活可达360.45IU/mg。同时，该肝素酶具有良好的热稳定性，50℃下的半衰期为10.6min，40℃下的半衰期为244min。表明该重组酶具有较大的工业应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用
本专利技术涉及一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
肝素(Heprain)是一种特异性质多分散的混合硫酸化多糖，广泛分布于哺乳动物组织中，以共价键形式和蛋白质结合。目前商业肝素主要是从牛肺和猪小肠黏膜中提，结构复杂且具有多种重要的生物学功能，一般在临床上用于血栓，心血管等疾病的治疗。低分子量肝素(Lowmolecularheparin，LMWH)是肝素通过某些物理化学方法裂解而产生的一小段肝素，与蛋白质或细胞结合的能力有所下降，但抗凝活性显著增加。与正常肝素相比，低分子肝素可降低抗因子IIa的活性，极大程度地减小了出血的危险性。目前制备低分子肝素有物理、化学、生物和合成方法。其中，生物酶解法由于具备条件温和、选择性强、污染小等优点，现已成为一种新兴的方法。肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一类能够裂解肝素类结构物质、制备低分子肝素的多糖裂解酶，来源比较广泛，主要存在于原核生物肝素黄杆菌中，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等。肝素酶I首先发现于肝素黄杆菌，可选择性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α(1-4)糖苷键。根据肝素酶I的各个来源的氨基酸序列以及蛋白结构特点，肝素酶I被划分为糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要应用于低分子肝素的制备、体外循环中肝素的消除、肝素确切结构的解析、以及在体外诊断试剂方面用于凝血试验和血小板实验。从自然界中得到的不同的产肝素酶微生物，所产肝素酶也多种多样，用于酶解肝素得到的产物也各不相同，目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，他们分别是分子量大约为43、78、66kDa的单体蛋白质，等电点均在9.0左右。肝素酶的发现为肝素结构研究和质量检测起了重要的推动作用，其中产自肝素黄杆菌的酶I、II、III已经用于肝素类质量检测和低分子肝素生产。随着对低分子肝素的研究不断深入。人们发现，低分子肝素除了具有抗凝活性外，还对肿瘤、炎症、产科妊娠等疾病具有广泛作用，针对低分子肝素的不同药理活性进行新药开发具有广阔的前景。但肝素的结构高度复杂，具有某种药理作用的活性位点在整个混合物中较少，而且容易受其它近似结构干扰，由此对药物开发带来干扰。而肝素酶对肝素的酶切位点比较专一，由此可分离得到较大量结构相同的片段，有利于药物开发。研究最多的是肝素酶I，但是目前肝素酶的热稳定性很差，导致其无法很好地适应工业化应用。这已经是阻碍酶法制备低分子肝素的瓶颈。因此，寻找热稳定性好的新型肝素酶，具有重要意义。虽然，公开号为CN109666666B的中国专利技术专利当中公开了一种肝素酶I，但是其来源于多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)，其原始酶的半衰期仅为6min，虽然该专利基于分子动力学的酶柔性分析提供了一种提高了肝素酶I热稳定性的突变体，但是突变酶的构建需要使用计算机进行分子动力学模拟和虚拟突变筛选，需要的门槛较高，难以实现广泛的推广。因此寻找挖掘热稳定性好的原始酶肝素酶I，仍然具有重要的意义。
技术实现思路
技术问题：本专利技术要解决的技术问题是：提供一种热稳定性高的肝素酶I及其应用，更新肝素酶I家族的菌株来源信息，以及挖掘筛选出具有热稳定性的肝素酶I，解决目前工业上肝素酶I热稳定性差的瓶颈；同时提供一种能够生产该肝素酶I的重组菌及一种生产低分子肝素的方法。技术方案为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种编码肝素酶I的基因，所述肝素酶I的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，本专利技术所阐述的肝素酶I为具有更好的热稳定性，对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要意义，提高肝素酶I在工业上的应用价值。在本专利技术的一种实施方式中，基因序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的肝素酶I分别命名为BnHepI和BfHepI。在本专利技术的一种实施方式中，所述BnHepI来源于Bacteroidesnordii诺迪拟杆菌FTJS11K9；所述BfHepI来源于Bacteroidesfinetgoldii细沟拟杆菌FNMHLBE3K7。在本专利技术的一种实施方式中，所述肝素酶BnHepI的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述肝素酶BfHepI的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述肝素酶I分别为BfHepI和BnHepI，分子量分别为42.3KDa，41.8KDa。本专利技术还提供了携带上述肝素酶I的基因的重组载体。本专利技术还提供了携带上述肝素酶I的基因，或上述重组载体的重组细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞为真菌或细菌。本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述编码肝素酶I的基因。在本专利技术的一种实施方式中，以pET-SUMO或pUC19为表达载体。在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌基因工程菌，是以大肠杆菌BL21或BL21Rosetta为表达宿主，优选地，宿主为大肠杆菌BL21。本专利技术还提供了一种构建上述重组大肠杆菌的方法，所述方法为：(1)化学合成核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示肝素酶BnHepI或肝素酶BfHepI。(2)以pET-SUMO为表达载体，将扩增得到的肝素酶I基因连接到表达载体上，构建重组表达载体pET-SUMO-BfHepI，pET-SUMO-BnHepI，将上述重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，筛选阳性转化子并测序验证。本专利技术提供了一种上述肝素酶I的生产方法，所述方法为，将上述重组大肠杆菌添加至种子培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600＝0.6，得到种子液；将制备得到的种子液按照1％(v/v)的比例转入发酵培养基中，28℃培养并加入终浓度为0.6mMisopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，诱导表达10-12h，转速200rpm。本专利技术提供了一种低分子肝素的制备方法，所述方法为：将上述肝素酶，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌添加至含有肝素的反应体系中进行反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述低分子肝素是指：通过肝素酶裂解之后得到的分子量小的肝素片段；低分子肝素是由普通肝素解聚制备而成的一类分子量较低的肝素的总称，平均分子量4000～6000KDa，肝素的分子量在12000KDa以上。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应温度为30～40℃。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系为50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠，pH7.4。本专利技术还提供了一种肝素的裂解方法，其特征在于，所述方法为：将上述肝素酶，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌添加至含有肝素的反应体系中进行反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种编码肝素酶I的基因，其特征在于，所述肝素酶I的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种编码肝素酶I的基因，其特征在于，所述肝素酶I的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
2.携带权利要求1所述的肝素酶I的基因的重组载体。
3.携带权利要求1所述的肝素酶I的基因，或权利要求2所述的重组载体的重组细胞。
4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了权利要求1编码肝素酶I的基因。
5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET-SUMO或pUC19为表达载体。
6.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，...
【专利技术属性】
技术研发人员：田丰伟，于雷雷，张川，翟齐啸，王晨，肖越，赵建新，张灏，陈卫，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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