通过临近使能反应疗法开发的共价蛋白质药物制造技术

本申请公开了一种用于生成共价蛋白质药物的临近使能反应疗法方法。潜在的生物反应性氨基酸FSY被掺入到人程序性死亡蛋白1(PD‑1)中，其在结合时选择性地与人PD‑L1的近端组氨酸反应，使得在体外在癌细胞上以及在小鼠中的肿瘤中PD‑1与PD‑L1不可逆地结合。当在人源化小鼠模型中施用时，共价的PD‑1(FSY)表现出超过野生型的强力的抗肿瘤效应，实现了与FDA批准的治疗性单克隆抗体阿特珠单抗相当的疗效。这种临近使能反应方式应当能提供用于将互作蛋白质转变成共价蛋白质药物以获得高疗效的通用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过临近使能反应疗法开发的共价蛋白质药物序列表本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容通过引用并入本文。
本申请总体上涉及用于生成共价蛋白质药物的临近使能反应疗法方法，以及包含一个潜在生物反应性非天然氨基酸(Uaa)突变蛋白质，所述突变蛋白质可用于通过该临近使能反应疗法(proximity-enabledreactivetherapeutics)开发的共价蛋白质药物。更具体地，本申请涉及包含o-氟硫酸-L-酪氨酸(fluorosulfate-L-tyrosine，FSY)的突变的PD-1，其制备方法，和所述突变的PD-1的应用。
技术介绍
小分子药物与其靶标以共价方式结合，尽管在历史上被药学研究人员和工业有意地回避，但在近年内以巨大的成功再度崛起1,2,3。药物和靶标之间的共价键合相比常规药物的非共价相互作用提供了多种期望的特性，包括增加的生物化学效力和功效，使药物代谢动力学持久的延长的作用持续时间，具有减小的剂量和给药频次的提高的治疗指数，使靶标完全失活，抑制不易治愈的靶标的机会3,4。到目前为止，几乎30％的市场上销售的靶向酶的药物通过共价机制起作用，并且靶向共价抑制逐渐被应用于更宽范围的对非共价药物来说有挑战性的靶标5,4。对于治疗挑战性的疾病来说，小分子共价药物相对于非共价药物提供多种期望的治疗特性。然而，由于蛋白质不能共价结合靶标，共价蛋白质药物的潜力仍然有大部分没有被开发出来。与小分子共价药物的顺利发展相反，共价蛋白质药物的治疗潜力仍然有大部分没有得到开发利用。蛋白质药物比小分子药物更适合于共价作用方式。小分子共价药物的一个主要问题是脱靶反应性1，脱靶反应性可以在共价蛋白质药物中被最小化，因为蛋白质具有较大的尺寸，并且通常具有比小分子更高的靶标特异性。开发共价小分子药物的关键是在反应性和选择性之间采取适宜的平衡4。开发共价蛋白质药物的挑战如下：天然蛋白质主要通过非共价相互作用进行相互作用并且对靶标上的天然氨基酸残基缺乏共价反应性。另外，氨基酸在蛋白质、细胞和体内的广泛存在对于实现针对靶标的反应选择性施加了巨大的障碍。因此，在本领域中对于开发突变蛋白一直存在着需求，所述突变蛋白能够通过与在患病细胞诸如肿瘤细胞上表达的靶蛋白上的天然氨基酸的共价相互作用而进行相互作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备能够通过与肿瘤上表达的靶蛋白上的天然氨基酸共价相互作用而相互作用的突变蛋白质。所述突变蛋白质可以用来开发共价蛋白质药物。在此本申请公开了一种用于开发共价蛋白质药物的临近使能反应疗法策略(图1)。通过扩增遗传密码6,7，潜在的生物反应性非天然氨基酸(Uaa)被引入至蛋白质药物中，所述Uaa具有低的化学反应性，在蛋白质内部和细胞中保持惰性。在所述蛋白质药物与其靶标结合后，生物反应性的Uaa将通过临近使能反应促进与靶标的天然残基选择性地反应8，在所述药物和所述靶标之间形成共价键。在一个实施方案中，专利技术人通过遗传方式将潜在的生物反应性Uaa,即o-氟硫酸-L-酪氨酸(FSY)9,掺入到人程序性死亡蛋白1(PD-1)中，并且表明得到的PD-1(FSY)在体外与细胞表面上的和在体内与肿瘤组织中的其天然配体PD-L1共价结合。与PD-1(WT)相比，发现PD-1(FSY)增强人幼稚T细胞的功能活性，并在人源化小鼠模型中以显著更高的功效抑制肿瘤生长，显示了与治疗性抗-PD-L1单克隆抗体相当的抗肿瘤效应，突显了由共价键所促进的疗效。在一个方面，本公开涉及用以生成共价蛋白质药物的临近使能反应疗法方法，所述方法包括：将潜在的生物反应性非天然氨基酸(Uaa)掺入到蛋白质药物中以生成突变蛋白质药物,其中所述突变蛋白质药物在药物-靶标结合后通过临近使能反应与其靶蛋白的靶天然残基反应，由此使得所述蛋白质药物能够与其靶标共价结合。在一个实施方案中，Uaa经遗传方式掺入到所述蛋白质药物中，例如借助于对Uaa特异的突变的氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，aaRS)通过在编码所述蛋白质药物的野生型蛋白的核苷酸序列中的期望位点处引入琥珀终止密码子(TAG)，所述对Uaa特异的突变的氨酰-tRNA合成酶(aaRS)被进化为响应于TAG密码子而掺入Uaa。在一个实施方案中，所述Uaa是FSY(o-氟硫酸-L-酪氨酸)，借助于用于正交tRNAPyl/FSYRS对的基因，通过在编码所述蛋白质药物的野生型蛋白的核苷酸序列中的期望位点处引入琥珀终止密码子(TAG)经遗传方式将其引入到蛋白质药物中，所述用于正交tRNAPyl/FSYRS对的基因被进化为响应于TAG密码子而掺入FSY。在一个实施方案中，所述蛋白质药物可以是免疫检查点的一个成员，并且其靶标，即，免疫检查点的另一成员，可以是在肿瘤细胞表面上表达的蛋白质。在一个实施方案中，所述免疫检查点可以选自，但不限于，PD-1/PD-L1、CTLA-4/CD80(CD86)、4-1BB/配体、OX40/配体、GITR/配体、LAG-3/配体、TIM-3/配体，等等。在一个实施方案中，所述突变蛋白质药物是在其氨基酸序列中含有一个FSY(o-氟硫酸-L-酪氨酸)的突变的PD-1(FSY)，其中所述突变的PD-1(FSY)能够与其靶PD-L1中的接近的选自Tyr、His或Lys的一个靶天然氨基酸残基通过点击化学硫-氟化物交换(SuFEx)特异性地反应。在一个方面，本公开涉及在其氨基酸序列中包含一个FSY(o-氟硫酸-L-酪氨酸)的突变的人PD-1(FSY)。在一个实施方案中，所述突变的PD-1(FSY)中的所述FSY残基能够与其靶PD-L1中的接近的选自Tyr、His或Lys的一个靶天然氨基酸残基通过点击化学硫-氟化物交换(SuFEx)特异性地反应。FSY的使用将在PD-1(FSY)和PD-L1之间生成共价键，形成具有极大亲和力的不可逆拮抗剂，这种极大亲和力是利用通过天然氨基酸诱变进化的任意高亲和力突变体都无法达到的。在一个实施方案中，所述FSY在下列位点中之一处引入至人PD-1中：75、77或129(根据野生型人PD-1(即，NCBI登录号：NP_005009.2)的氨基酸序列编号)，分别靶向PD-L1的Lys124、Lys124和His69。在一个实施方案中，所述FSY在位点75或129处，优选在位点129处引入至人PD-1中。在一个实施方案中，所述FSY残基通过在宿主细胞中表达包含在期望位点处引入的琥珀终止密码子(TAG)的PD-1基因与用于正交tRNAPyl/FSYRS对的基因而掺入到人PD-1的胞外结构域中，所述用于正交tRNAPyl/FSYRS对的基因被进化为响应于TAG密码子而掺入FSY。在一个实施方案中，所述宿主细胞可以选自，但不限于，大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)或昆虫细胞。在一个实施方案中，所述突变的人PD-1(FSY)可以在体外与人PD-L1特异性地共价结合，与在活的癌细胞的表面上生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生成共价蛋白质药物的临近使能反应疗法方法，所述方法包括：将潜在的生物反应性非天然氨基酸(Uaa)掺入到蛋白质药物中以生成突变蛋白质药物,其中所述突变蛋白质药物在药物-靶标结合后通过临近使能反应与其靶蛋白的靶天然残基反应，由此使得所述蛋白质药物能够与其靶标共价结合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生成共价蛋白质药物的临近使能反应疗法方法，所述方法包括：将潜在的生物反应性非天然氨基酸(Uaa)掺入到蛋白质药物中以生成突变蛋白质药物,其中所述突变蛋白质药物在药物-靶标结合后通过临近使能反应与其靶蛋白的靶天然残基反应，由此使得所述蛋白质药物能够与其靶标共价结合。


2.根据权利要求1所述的方法，其中将Uaa经遗传方式掺入到所述蛋白质药物中。


3.根据权利要求2所述的方法，其中借助于对Uaa特异的突变的氨酰-tRNA合成酶(aaRS)，通过在编码所述蛋白质药物的野生型蛋白的核苷酸序列中的期望位点处引入琥珀终止密码子(TAG)来将Uaa经遗传方式掺入到所述蛋白质药物中。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述Uaa是o-氟硫酸-L-酪氨酸(FSY)且所述aaRS是对FSY特异的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。


5.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变蛋白质药物是在其氨基酸序列中含有一个FSY的突变的PD-1。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述FSY在下列位点中的一个处被引入至人PD-1中：Gln75、Asp77或Ala129，以取代在所述位点处各自的天然氨基酸残基，所述位点的编号依照野生型人PD-1的氨基酸序列。


7.一种突变的人PD-1，所述突变的人PD-1在其氨基酸序列中包含一个FSY(o-氟硫酸-L-酪氨酸)，其中所述突变的人PD-1中的FSY残基能够与其靶PD-L1中的接近的选自Tyr、His或Lys的一个靶天然氨基酸残基通过点击化学硫-氟化物交换(SuFEx)特异性地反应。


8.根据权利要求7所述的包含一个FSY的突变的人PD-1，其中所述FSY在下列位点中的一个处引入至人PD-1中：Gln75、Asp77或Ala129，以取代所述位点处各自的天然氨基酸残基，所述位点的编号依照野生型人PD-1的氨基酸序列。


9.根据权利要求8所述的包含一个FSY的突变的人PD-1，其中所述FSY在位点Ala129处引入至人PD-1中。


10.根据权利要求7所述的包含一个FSY的突变的人PD-1，其中通过在宿主细胞中表达包含在期望位点处引入的琥珀终止密码子(TAG)的PD-1基因与用于正交tRNAPyl/FSYRS对的基因将所述FSY残基掺入到人PD-1的胞外结构域中。


11.根据权利要求10所述的包含一个FSY的突变的人PD-1，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)或昆虫细胞。


12.根据权利要求10所述的包含一个FSY的突变的人PD-1，其中所述突变的人PD-1表现出下列特性：
(i)在体外与人PD-L1特异性地共价结合，与在活的癌细胞的表面上生理性地表达的人PD-L1特异性地共价结合，以及在体内与肿瘤组织中的人PD-L1特异性地共价结合；
(ii)通过阻断PD-1/PD-L1相互作用特异性地增强T细胞激活；和
(iii)实现与以相同的摩尔量施用的阿特珠单抗相同的抗肿瘤效应，而所需的PD-1(FSY)的质量为阿特珠单抗的十分之一。


13.根据权利要求7所述的包含一个FSY的突变的人PD-1，所述突变的人PD-1具有如SEQIDNO:23-25中任一个所示的氨基酸序列。


14.一种经遗传方式将FSY掺入至PD-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王谦，
申请(专利权)人：中国科学院理化技术研究所杭州研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33