通过多同位素体反应监测使用样品内校准曲线的分析方法技术

本公开文本提供LC‑MS/MS分析中的几种方法：(1)一种用于确定样品的分析物浓度的LC‑MS/MS分析技术的方法，其中通过经由MS/MS以多同位素体反应监测(MIRM)模式监测每个样品中所添加稳定的同位素标记的(SIL)分析物的多同位素体跃迁，使用样品内校准曲线(ISCC)代替外部校准曲线；(2)一种用于确定样品的分析物浓度的LC‑MS/MS分析的方法，其中使用单样品多点外部校准曲线(OSMECC)代替多样品外部校准曲线；以及(3)一种用于确定分析物浓度超出测定ULOQ的样品的分析物浓度的LC‑MS/MS分析的方法，其中在样品制备期间基于计算所监测MIRM通道的同位素丰度使用同位素样品稀释代替物理稀释样品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过多同位素体反应监测使用样品内校准曲线的分析方法相关申请的交叉引用本申请要求对2018年12月4日提交的美国临时申请号62/775,318的优先权。美国临时申请号62/775,318的全部内容是通过引用特此并入本文。通过EFS-WEB电子提交的序列表的引用本申请包括通过EFS-Web电子提交的序列表(名称：“3338_148PC01_SL_ST25.txt”；大小：844字节；创建日期：2019年12月3日)，其通过引用以其整体特此并入。
技术介绍
随着最近转化医学研究的快速发展，临床前和临床研究中生物标记的定量确定以及定量蛋白质组学已经在分子和细胞生物学研究、药物发现和开发中发挥甚至更重要的作用，如鉴定和验证潜在的生物标记，促进患者分层和剂量选择，用作替代终点以及在作用部位建立PK/PD关系。众所周知，使用在与真正研究样品相同的生物基质中制备的外部校准曲线，以及在外部校准曲线和真正研究样品二者中使用稳定的同位素标记的(SIL)分析物作为测定内标，是开发用于在生物基质中定量确定小分子药物和生物治疗药的准确且稳健的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定的关键。然而，对于临床前和临床研究中的生物标记测量，由于生物标记的内源性，在许多情况下在可靠基质中使用外部校准曲线及可靠参考标准是不可能的。在可靠基质中用SIL替代分析物制备外部校准曲线是替代方案之一，并且可以提供与在可靠基质中使用可靠分析物的测定的性能相同的测定性能，因为SIL替代分析物与可靠分析物关于样品提取、色谱分离、MS电离、碎裂和检测具有“相同的”物理化学特性。然而，这种方法并不易用，因为需要另一种形式的SIL分析物来作为测定内标，并且两种形式的SIL分析物的获得成本极高且非常耗时，特别是对于蛋白质的分析来说。因此，需要开发其他方法用于在药物开发的临床前或临床阶段中进行生物标记、药物或其代谢物的定量LC-MS/MS分析。
技术实现思路
本公开文本涉及一种用于对样品中至少一种分析物的浓度进行定量的LC-MS/MS技术，所述方法包括将一个或多个已知量的一种或多种稳定的同位素标记的(SIL)分析物添加至含有至少一种分析物的样品以通过每种所添加SIL分析物的多同位素体反应监测(MIRM)构建一条或多条样品内校准曲线(ISCC)，其中SIL分析物的MIRM是指对SIL分析物的多同位素跃迁的多反应监测；其中每种分析物的ISCC是基于MIRM跃迁中计算的理论同位素丰度(分析物浓度当量)与相应MIRM跃迁中测量的串联质谱(MS/MS)峰面积之间的关系在样品中构建；其中样品中至少一种分析物的浓度是使用已建立的ISCC和来自液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)过程的所述分析物的测量的峰面积来定量，并且其中串联质谱仪是以多反应监测模式来操作。在一些方面，分析物、SIL分析物和SIL分析物的天然存在的同位素体在质谱仪中电离以产生分析物、SIL分析物和SIL分析物的天然存在的同位素体的质子化的(或去质子化的)母离子。在一些方面，质谱仪中分析物的母离子、SIL分析物的母离子和SIL分析物的天然存在的同位素体的母离子在相同切割位点碎裂以产生中性丢失和子离子；在一些方面，在质谱仪中监测分析物从母离子跃迁至子离子，并测量分析物从母离子跃迁至子离子的峰面积。在一些方面，在质谱仪中监测从SIL分析物的母离子和SIL分析物的天然存在的同位素体的母离子至SIL分析物的子离子和SIL分析物的天然存在的同位素体的子离子的所选多重跃迁(“多同位素体反应监测”或“MIRM”)；在一些方面，测量每次MIRM跃迁的峰面积，其中所述MIRM跃迁包括从SIL分析物的母离子和SIL分析物的天然存在的同位素体的母离子至SIL分析物的子离子和SIL分析物的天然存在的同位素体的子离子的所选跃迁。在一些方面，样品内校准曲线是基于SIL分析物和SIL分析物的天然存在的同位素体的MIRM跃迁中测量的峰面积与每次MIRM跃迁的分析物浓度当量之间的关系生成的。在一些方面，每次MIRM跃迁的分析物浓度当量是从SIL分析物或SIL分析物的天然存在的同位素体的相应MIRM跃迁的理论同位素丰度计算的，其中理论同位素丰度是使用AnalyticalChemistry,2012,84(11),4844-4850中公开的方法计算的，其中所述方法是基于SIL分析物的中性丢失和子离子的同位素分布计算的。在其他方面，对于单位分辨率三重四极质谱仪，SIL分析物和SIL分析物的天然存在的同位素体从(p+Zp+α)/Zp至(d+Zd+β)/Zd的每次MIRM跃迁(m/z)的理论同位素丰度是基于式(I)来计算：(p+Zp+α)/Zp→(d+Zd+β)/Zd的MIRM跃迁中的同位素丰度＝[质量为(d+Zd+β)的子离子的相对同位素分布]*[质量为n+(α-β)的中性丢失的相对同位素分布](I)其中m/z是质荷比p是SIL分析物的母分子的单一同位素质量Zp是母离子的电荷数d是SIL分析物的子片段的单一同位素质量Zd是子离子的电荷数n是SIL分析物的中性丢失的单一同位素质量p＝d+nα和β是整数，它们分别是母离子和子离子上另外的中子数，α≥0，β≥0并且α≥βZp和Zd是整数在一些方面，同位素丰度计算器位于worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html(2019年11月10日访问)。在一些方面，其中最高分析物浓度当量(ISCC的“定量上限”或“ULOQ”)是基于式(II)来计算：(M/V)*(M分析物/MSIL分析物)ng/mL(II)其中M(ng)是添加至样品中的SIL分析物的总量；V是添加SIL分析物之前的样品体积(mL)；M分析物是分析物的分子量；MSIL分析物是SIL分析物的分子量。在一些方面，MIRM跃迁中的一个或多个其他分析物浓度当量是基于式(III)来计算：Ia*ULOQ(ng/ml)(III)其中Ia是SIL分析物或SIL分析物的天然存在的同位素体的MIRM跃迁的计算的理论同位素丰度。本专利技术方法可有效使用相应SIL分析物检测或定量作为蛋白质的分析物。在一些方面，所述分析物是蛋白质或肽。在一些方面，所述SIL分析物是稳定的同位素标记的蛋白质或肽。在一些方面，分析物的母离子和SIL分析物的母体包含至少约3个氨基酸、至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸或至少约20个氨基酸。在一些方面，分析物的母离子和SIL分析物的母离子包含4个与20个氨基酸之间、4个与15个氨基酸之间、5个与15个氨基酸之间、4个与14个氨基酸之间、5个与14个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于对样品中至少一种分析物的浓度进行定量的方法，所述方法包括将一个或多个已知量的一种或多种稳定的同位素标记的(SIL)分析物添加至含有至少一种分析物的样品以通过每种所添加SIL分析物的多同位素体反应监测(MIRM)构建一条或多条样品内校准曲线(ISCC)，其中SIL分析物的MIRM是指所述SIL分析物的多同位素跃迁的多反应监测；其中每种分析物的ISCC是基于MIRM跃迁中计算的理论同位素丰度(分析物浓度当量)与相应MIRM跃迁中测量的串联质谱(MS/MS)峰面积之间的关系在所述样品中构建；其中所述样品中至少一种分析物的浓度是使用已建立的ISCC和来自液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)过程的所述分析物的测量的峰面积来定量，并且其中串联质谱仪是以多反应监测模式来操作。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181204 US 62/775,3181.一种用于对样品中至少一种分析物的浓度进行定量的方法，所述方法包括将一个或多个已知量的一种或多种稳定的同位素标记的(SIL)分析物添加至含有至少一种分析物的样品以通过每种所添加SIL分析物的多同位素体反应监测(MIRM)构建一条或多条样品内校准曲线(ISCC)，其中SIL分析物的MIRM是指所述SIL分析物的多同位素跃迁的多反应监测；其中每种分析物的ISCC是基于MIRM跃迁中计算的理论同位素丰度(分析物浓度当量)与相应MIRM跃迁中测量的串联质谱(MS/MS)峰面积之间的关系在所述样品中构建；其中所述样品中至少一种分析物的浓度是使用已建立的ISCC和来自液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)过程的所述分析物的测量的峰面积来定量，并且其中串联质谱仪是以多反应监测模式来操作。


2.根据权利要求1所述的方法，其中
(i)所述分析物、所述SIL分析物和所述SIL分析物的天然存在的同位素体在所述质谱仪中电离以产生所述分析物、所述SIL分析物和所述SIL分析物的天然存在的同位素体的质子化的(或去质子化的)母离子；
(ii)所述质谱仪中所述分析物的母离子、所述SIL分析物的母离子和所述SIL分析物的天然存在的同位素体的母离子在相同切割位点碎裂以产生中性丢失和子离子；
(iii)在所述质谱仪中监测所述分析物从母离子跃迁至子离子；
(iv)测量所述分析物从母离子跃迁至子离子的峰面积；
(v)在所述质谱仪中监测从所述SIL分析物的母离子和所述SIL分析物的天然存在的同位素体的母离子至所述SIL分析物的子离子和所述SIL分析物的天然存在的同位素体的子离子的所选多重跃迁(“多同位素体反应监测”或“MIRM”)；
(vi)测量每次MIRM跃迁的峰面积，其中所述MIRM跃迁包括从所述SIL分析物的母离子和所述SIL分析物的天然存在的同位素体的母离子至所述SIL分析物的子离子和所述SIL分析物的天然存在的同位素体的子离子的所选跃迁；


3.根据权利要求2所述的方法，其基于所述SIL分析物和所述SIL分析物的天然存在的同位素体的MIRM跃迁中测量的峰面积与每次MIRM跃迁的分析物浓度当量之间的关系进一步生成样品内校准曲线。


4.根据权利要求3所述的方法，其中每次MIRM跃迁的分析物浓度当量是从所述SIL分析物或所述SIL分析物的天然存在的同位素体的相应MIRM跃迁的理论同位素丰度计算的，其中理论同位素丰度是使用AnalyticalChemistry,2012,84(11),4844-4850中公开的方法来计算，其中所述方法是基于所述SIL分析物的中性丢失和子离子的同位素分布计算的。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述SIL分析物和所述SIL分析物的天然存在的同位素体从(p+Zp+α)/Zp至(d+Zd+β)/Zd的每次MIRM跃迁(m/z)的理论同位素丰度是基于式(I)来计算：
(p+Zp+α)/Zp→(d+Zd+β)/Zd的MIRM跃迁中的同位素丰度＝[质量为(d+Zd+β)的子离子的相对同位素分布]*[质量为n+(α-β)的中性丢失的相对同位素分布](I)
其中m/z是质荷比
p是所述SIL分析物的母分子的单一同位素质量
Zp是母离子的电荷数
d是所述SIL分析物的子片段的单一同位素质量
Zd是子离子的电荷数
n是所述SIL分析物的中性丢失的单一同位素质量
p＝d+n
α和β是整数，它们分别是所述母离子和子离子上另外的中子数，α≥0，β≥0并且α≥β
Zp和Zd是整数


6.根据权利要求4和5所述的方法，其中同位素分布计算器位于worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html(2019年11月10日访问)。


7.根据权利要求6所述的方法，其中最高分析物浓度当量(ISCC的“定量上限”或“ULOQ”)是基于式(II)来计算：
(M/V)*(M分析物/MSIL分析物)ng/mL(II)
其中M(ng)是添加至所述样品中的所述SIL分析物的总量；
V是添加所述SIL分析物之前的样品体积(mL)；
M分析物是所述分析物的分子量；
MSIL分析物是所述SIL分析物的分子量。


8.根据权利要求7所述的方法，其中MIRM跃迁中的一个或多个其他分析物浓度当量是基于式(III)来计算：
Ia*ULOQ(ng/mL)(III)
其中Ia是所述SIL分析物或所述SIL分析物的天然存在的同位素体的MIRM跃迁的计算的理论同位素丰度。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分析物是蛋白质或肽。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述SIL分析物是稳定的同位素标记的蛋白质或肽。


11.根据权利要求10所述的方法，其中所述SIL分析物的母离子包含至少约3个氨基酸、至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸或至少约20个氨基酸。


12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述SIL分析物的母离子包含4个与20个氨基酸之间、4个与15个氨基酸之间、5个与15个氨基酸之间、4个与14个氨基酸之间、5个与14个氨基酸之间、5个与13个氨基酸之间、5个与12个氨基酸之间、6个与15个氨基酸之间、6个与14个氨基酸之间、6个与13个氨基酸之间、6个与12个氨基酸之间、6个与11个氨基酸之间、6个与10个氨基酸之间、6个与9个氨基酸之间、6个与8个氨基酸之间、7个与15个氨基酸之间、7个与14个氨基酸之间、7个与13个氨基酸之间、7个与12个氨基酸之间、7个与11个氨基酸之间、7个与10个氨基酸之间或7个与9个氨基酸之间的氨基酸序列。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述分析物是抗体。


14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述分析物是融合蛋白。


15.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述分析物是PD-1、PD-L1、CD73、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD73抗体或其任何组合。


16.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分析物是小分子。


17.根据权利要求16所述的方法，其中所述小分子的摩尔质量为至少约100g/mol、至少约200g/mol、至少约300g/mol、至少约400g/mol、至少约500g/mol、至少约600g/mol、至少约700g/mol、至少约800g/mol、至少约900g/mol、至少约1000g/mol、至少约1100g/mol、至少约1200g/mol、至少约1300g/mol、至少约1400g/mol、至少约1500g/mol、至少约1600g/mol、至少约1700g/mol、至少约1800g/mol、至少约1900g/mol或至少约2000g/mol。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述SIL分析物含有至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19或至少约20个稳定的同位素标记。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述SIL分析物含有约3至约20个同位素标记、约3至约19个同位素标记、约3至约15个同位素标记、约3至约10个同位素标记、约3至约8个同位素标记、约3至约7个同位素标记、约3至约6个同位素标记、约4至约15个同位素标记、约4至约10个同位素标记、约4至约8个同位素标记、约4至约7个同位素标记、约4至约6个同位素标记、约5至约8个同位素标记、约5至约7个同位素标记、约6至约10个同位素标记、约6至约8个同位素标记、约7至约16个同位素标记、约7至约16个同位素标记、约8至约16个同位素标记、约8至约15个同位素标记、约9至约15个同位素标记、约9至约14个同位素标记、约10至约14个同位素标记、约10至约13个同位素标记或约11至约13个同位素标记。


20.根据权利要求2至19中任一项所述的方法，其中与所述SIL分析物或所述SIL分析物的天然存在的同位素体的相应MIRM跃迁中计算的理论同位素丰度相比，MIRM跃迁中每个测量的相对峰面积具有小于15％偏差。


21.根据权利要求20所述的方法，其中与所述SIL分析物或所述SIL分析物的天然存在的同位素体的相应MIRM跃迁中计算的理论同位素丰度相比，MIRM跃迁中至少一个测量的相对峰面积具有小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或小于0.0001％的偏差。


22.根据权利要求21所述的方法，其中与所述SIL分析物或所述SIL分析物的天然存在的同位素体的相应跃迁中计算的理论同位素丰度相比，MIRM跃迁中至少一个测量的相对峰面积具有1％与15％之间的偏差。


23.根据权利要求22所述的方法，其中所述MIRM跃迁的数量是至少二、至少三、至少四、至少五、至少六、至少七、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20。


24.根据权利要求23所述的方法，其中所述MIRM跃迁的数量在2与20之间。


25.根据权利要求2至24中任一项所述的方法，其中最高MIRM和最低MIRM的分析物浓度当量是至少约10、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900或至少约2000倍差异。


26.根据权利要求4至25中任一项所述的方法，其中两个所选MIRM跃迁的计算的理论同位素丰度相差至少0.01％、相差至少0.05％、相差至少0.1％、相差至少0.5％、相差至少1％、相差至少1.5％、相差至少2％、相差至少2.5％、相差至少3％、相差至少3.5％、相差至少4％、相差至少4.5％、相差至少5％、相差至少5.5％、相差至少6％、相差至少6.5％、相差至少7％、相差至少7.5％、相差至少8％、相差至少8.5％、相差至少9％、相差至少9.5％、相差至少10％、相差至少20％、相差至少30％、相差至少40％或相差至少约50％。


27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述SIL分析物含有少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.4％、少于0.3％、少于0.2％或少于0.1％未标记分析物。


28.根据权利要求1至27中...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·顾，Y·赵，曾加宁，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：美国;US