物种鉴定的新方法技术

本文提供了一种用于鉴定培养细胞的特异性细胞谱系的方法，其包括以下步骤：从所述培养重组细胞中分离出的核酸分子中确定所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少5处不同位置的多态性或SNP的存在，从上一步骤的确定中获得遗传概况，以及从所述遗传概况中鉴定所述培养细胞的细胞谱系，且其中重组细胞产生重组蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】物种鉴定的新方法专利
本专利技术涉及生物学系统，更具体地涉及使用基因组和计算机分析用于生物生产生物分子。具体来说涉及特定细胞谱系和细胞库特征鉴定方法，可用于所述方法中的用于扩增的引物和SNP。
技术介绍
对制药行业来说重组治疗剂的生产越来越重要。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系是生产重组蛋白最常用的细胞的部分。在制药行业中熟知和常用的其他细胞系例如NS0或SP2/0。这些细胞已经被监管部门重复地批准。它们可以在悬液中容易地培养，且能产生高滴度的人相容性治疗蛋白。在通过培养细胞重组生产药物的批准之前和之后，卫生部门都要求进行鉴定测试以确认哺乳动物宿主细胞。例如，需要进行鉴定测试以证明所用细胞库在一段时间内是稳定的且没有交叉污染。传统的测试是基于同工酶分析，可以在电泳凝胶上显示物种特异性的迁移模式。这些测试是基于四种不同同工酶在电泳模式中的差异，能够区分人、鼠和仓鼠物种间的差异。然而这些酶学测试需要的试剂可能变得稀少且实施繁琐。其他缺点包括这些测试的灵敏度不足以符合当前大多数可接受的标准。因此，需要鉴定特定细胞谱系和细胞库表征的可替代的有效方法。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术公开了一种用于鉴定培养细胞的特定细胞谱系的方法，其包括以下步骤：1)从所述培养重组细胞中分离的核酸分子中确定在所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少5处不同位置，更有利地至少10处不同位置，甚至更有利地至少20处不同位置的多态性或SNP的存在，2)从步骤1)的确定中获得遗传概况(geneticprofile)，和3)从所述遗传概况中鉴定所述培养细胞的细胞谱系；其中至少5个基因是：阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)，并且其中重组细胞产生重组蛋白。在本专利技术的第二方面，本文所述的是一种分析方法，其包括以下步骤：1)分析从培养重组细胞中分离的核酸分子以确定所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少5处不同位置，更有利地至少10处不同位置，甚至更有利地至少20处不同位置的多态性或SNP的存在，2)从步骤1)分析中获得遗传概况，和3)从所述遗传概况中确定所述培养重组细胞的物种；其中至少5个基因是：阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)，并且其中重组细胞产生重组蛋白。在第三方面，本专利技术涉及一种用于培养重组细胞的细胞库表征的方法，其包括以下步骤：1)确定从所述培养重组细胞中分离的核酸分子中的至少5个基因内至少5处不同位置，更有利地至少10处不同位置，甚至更有利地至少20处不同位置的多态性或SNP的存在，2)从步骤1)分析中获得遗传概况，以及3)从所述遗传概况中表征培养重组细胞的细胞库起源，其中至少5个基因是：阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)，并且其中重组细胞产生重组蛋白。专利技术详述本文描述的是允许鉴定细胞的特定细胞谱系和细胞库表征的物种特异性单核苷酸(SNP)组合。得益于这些SNP组合，能够简便地在物种间区分(例如：小鼠、CHO、人等)。总之，本方法是基于分析动物物种(例如哺乳动物物种)间5个高保守基因序列上发现的SNP的差异，利用PCR(聚合酶链反应)和测序方法。SNP的差异允许创建一种物种特异性的模式，通过生物信息学软件分析确认细胞系身份并检测其他物种细胞系的任意污染。本方法的多个优点如下：1)无同工酶分析试剂，2)稳健性(只需要5个不同基因上的5、10或20个SNP)；《类似法医》方法)，3)灵敏性，4)鉴定潜在污染及5)成本效益的。表1显示了根据本专利技术每个物种可以用于检测的5个基因的一些SNP。这五个基因为阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)。来源物种的鉴定是由测试样品中至少5个，更有利地至少10个，甚至更有利地至少20个SNP的存在得出的。就本专利技术整体而言，如表1所述的任意SNP的组合中选择优选的至少20个SNP。实际上，专利技术人表示使用这些SNP能够非常精确地鉴定/表征细胞系/细胞谱系。NGS＝例如焦磷酸测序(PyroSequencing)、Solexa-Illumina、固态或离子激流(SolidorIonTorrent)或牛津纳米孔(OxfordNanopore)。实施例引言
技术实现思路
：该方法涉及培养分析的细胞系(样品)和准备细胞沉淀。从样品中提取出的基因组DNA经历5个不同的PCR反应，分别使用感兴趣的5个基因各一对特异性引物。这些引物扩增基因中SNP所在的区域。随后，从纯化的PCR产物开始，制备文库以加载到MiSeq(亿明达(Illumina))测序仪上进行测序。然后使用特定的生物信息学流程分析产生的数据，其允许鉴定样品细胞系的来源，以及任何其他物种细胞系的存在。本方法可用于分析(非限制性示例)：-用于生产重组蛋白的细胞库-在病毒安全(ViralSafety)检测中使用的细胞系-用于增殖病毒并在病毒清除验证(ViralClearanceValidation)研究中用作测试系统的细胞系。细胞系和抗体：-CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞系),ATCCCCL-61，-MRC-5(人肺成纤维细胞),ATCCCCL-171，-Sp2/0-Ag14(小鼠，非分泌杂交瘤),ATCCCRL-1581，-mAb1细胞,表达,Ab1,基于CHO-S，-mAb2细胞,表达,Ab1,基于Sp2/0-Ag14。主要材料/试剂盒-QiaAmpDNABlood试剂盒(凯杰公司(Qiagen))-RNA酶，无DNA酶(罗氏公司(Roche))-dNTP(生命技术公司(LifeTechnologies)或同等产品)-GeneAmp高保真PCR系统(生命技术公司)-引物(生命技术公司或同等产品)：参见表2-MinElutePCR纯化试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))-NexteraXT样品制备试剂盒–盒1和盒2(亿明达(Illumina))-NexteraXTIndex试剂盒(亿明达)-QubitdsDNAHS测定试剂盒(生命技术公司)-Agilent高灵敏度DNA试剂盒(安捷伦(Agilent))-PhiX对照v3(亿明达)-MiSeq试剂Nano试剂盒v2(300次循环)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定培养细胞的特异性细胞谱系的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述培养重组细胞中分离出的核酸分子中确定在所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少20个不同位置处的多态性或SNP的存在，2)从步骤1)的确定中获取遗传概况，以及3)从所述遗传概况中鉴定所述培养细胞的细胞谱系；/n其中所述至少5个基因是：阿尔古RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)，且其中所述重组细胞产生重组蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181116 EP 18206755.31.一种用于鉴定培养细胞的特异性细胞谱系的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述培养重组细胞中分离出的核酸分子中确定在所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少20个不同位置处的多态性或SNP的存在，2)从步骤1)的确定中获取遗传概况，以及3)从所述遗传概况中鉴定所述培养细胞的细胞谱系；
其中所述至少5个基因是：阿尔古RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)，且其中所述重组细胞产生重组蛋白。


2.一种分析方法，所述方法包括以下步骤：1)分析从培养重组细胞中分离出的核酸分子以确定在所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少20个不同位置处的多态性或SNP的存在，2)从步骤1)的分析中获取遗传概况，以及3)从所述遗传概况中鉴定所述培养重组细胞的物种；
其中所述至少5个基因是：阿尔古RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)，且其中所述重组细胞产生重组蛋白。


3.一种用于对培养重组细胞进行细胞库表征的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述培养重组细胞中分离出的核酸分子中确定在至少5个基因中至少20个不同位置处的多态性或SNP的存在，2)从步骤1)的检测中获取遗传概况，以及3)从所述遗传概况中表征所述培养重组细胞的细胞库起源；
其中所述至少5个基因是：阿尔古RISC催化组分1(Ago1)，细胞色素b(Cytb)，组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1)，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)，且其中所述重组细胞产生重组蛋白。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述遗传概况与所述培养重组细胞的细胞谱系、物种和/或细胞库起源有关。


5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤3)是通过将所述遗传概况与参考遗传概况进行比较，其中所述比较指示所述培养重组细胞的细胞谱系、物种和/或细胞库起源。


6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述至少5个基因中的所述至少20个不同位置处的多态性或SNP的存在是根据一种方法确定的，其包含以下步骤：a)从培养细胞中分离重组细胞样品，2)从步骤1)中分离的细胞中分离核酸分子，3)将特异性引物对与包括至少5个感兴趣的基因的核酸分子杂交；4)扩增所述核酸分子以获得扩增的核酸分子片段，以及5)对所述核酸分子片段进行测序。


7.如权利要求6所述的方法，其中所述特异性引物对产生配对末端序列，允许从所...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·贝克曼，F·拉耐芙，
申请(专利权)人：阿雷斯贸易股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH