改善基因疗法的新工具及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种用于增加由转基因编码的蛋白质或多肽的水平和/或活性的编码人白蛋白的核酸分子，及其在含有肝脏特异性调节元件和密码子优化的因子IX、因子VIII、因子VII或因子VIIa转基因的核酸表达盒和载体中的用途，以及采用这些表达盒和载体的方法及其用途，所述核酸分子包含由SEQ ID NO:14定义的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的序列。本发明专利技术特别适用于使用肝脏定向基因疗法的应用，尤其适用于治疗血友病A、血友病B或因子VII缺陷。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善基因疗法的新工具及其用途
本专利技术涉及能够增强(转)基因的组织特异性表达和/或活性的新工具、采用这些工具的方法及其用途。本专利技术还包括表达系统和包含这些表达系统的药物组合物。本专利技术特别适用于使用基因疗法、更具体而言组织定向基因疗法的应用，以及适用于疫苗接种目的。
技术介绍
血友病B是由凝血因子IX(FIX)缺乏引起的X连锁隐性出血性疾病。血友病A是一种严重的出血性疾病，是缺乏或完全不存在由肝脏产生的凝血因子VIII(FVIII)所引起。血友病A和B的临床表现以自发性和长期出血发作为特征。据估计，5,000人中有1人患有血友病A，20,000人中有1人患有血友病B。目前，血友病A和B通过使用血浆衍生的或重组的FVIII或FIX的蛋白质替代疗法进行治疗。尽管蛋白质替代大幅提高了血友病患者的预期寿命，他们仍然面临严重出血发作和慢性关节损伤的风险，因为预防性治疗受到半衰期短、有效性有限和高成本的纯化凝血因子限制，纯化凝血因子的成本接近100,000美元/患者/年。此外，使用从污染的血源获得的血浆衍生因子会增加病毒传播的风险。基因疗法提供了治疗血友病B的新方法的希望，因为治疗窗口相对较宽，略高于正常生理水平1％的水平就能产生疗效。如果成功，基因疗法可以在肝脏中提供恒定的FVIII或FIX合成，从而可导致治愈这种疾病。血友病基因疗法的不同模式已进行了广泛的论述，例如在Chuah等人，2012a，2012b，2012c；VandenDriessche等人，2012；High2001，2011；和Matrai等人，2010a，2010b中。国际血栓形成和止血学会科学和标准化委员会(theScientificandStandardizationCommitteeoftheInternationalSocietyonThrombosisandHaemostasis)因子VIII和因子IX小组委员会(thesubcommitteeonFactorVIIIandFactorIX)分别根据FVIII水平和FIX水平将血友病A和血友病B的严重程度分为三级：1)重度(FVIII或FIX水平低于0.01国际单位(IU)/ml，即低于正常FVIII或FIX水平的1％)；2)中度(FVIII或FIX水平为0.01到0.05IU/ml，即为正常FVIII或FIX水平的1至5％)；以及3)轻度(FVIII或FIX水平高于0.05至0.4IU/ml，即高于正常FVIII或FIX水平的5至40％)。血友病A是最常见的遗传性凝血疾病，其发病率接近1/5000名男性。使用纯化或重组的FVIII和FIX的蛋白替代疗法(PST)显著改善了患者的生活质量。然而，PST不能治愈，患者仍有可能发生危及生命的出血和严重的关节炎症。不幸的是，许多患有血友病A(高达40％)的患者在进行PST后产生了FVIII的中和抗体(即“抑制剂”)。同样，估计10％血友病B的患者会产生FIX的“抑制剂”。这些抑制剂使出血发作的管理复杂化，并可能使PST进一步失效。这些血友病患者可以用因子VIIa治疗，因子VIIa即使面对FVIII或FIX的中和抗体也能进行止血矫正。PST的这些局限性证明了基因疗法发展为血友病治疗的潜在替代疗法的合理性。此外，仅需要适度增加FIX或FVIII血浆浓度就能产生治疗益处，超过正常水平的1％的水平就能够显著降低自发性出血和长期关节病的发生率。肝脏是FIX和FVIII合成的主要生理部位，因此，肝细胞是非常适合血友病基因治疗的靶细胞。FIX或FVIII蛋白很容易从这个位置进入血液循环。此外，肝脏壁龛(niche)可有利于诱导对转基因产物的免疫耐受(Annoni等人，2007；Follenzi等人，2004；Brown等人，2007；Herzog等人，1999；Matrai等人，2011；Matsui等人，2009)。血友病肝脏定向基因疗法可以用不同的病毒载体完成，包括逆转录病毒载体(Axelrod等人，1990；Kay等人，1992；VandenDriessche等人，1999；Xu等人，2003，2005)、慢病毒载体(Ward等人，2011；Brown等人，2007；matrai等人，2011)、腺相关病毒载体(AAV)(Herzog等人，1999)和腺病毒载体(Brown等人，2004；Ehrhardt&Kay，2002)。AAV是一种具有单链DNA基因组的天然存在的复制缺陷型非致病性病毒。AAV载体具有良好的安全性，并且能够实现持续的转基因表达。长期表达主要由游离留存的AAV基因组介导。超过90％的稳定转导的载体基因组存在于染色体外，主要组织成高分子量串联体(concatamer)。因此，插入性肿瘤形成的风险很小，尤其是在血友病基因疗法的背景下，预计不会发生转导细胞的选择性扩增。AAV载体的主要局限在于载体颗粒有限的包装能力(即约5.0kb，包括AAV反向末端重复序列)，从而限制了转基因表达盒的大小以获得功能性载体(Jiang等人，2006)。已从人和非人灵长类动物中分离出几种免疫学上不同的AAV血清型(Gao等人，2002；Gao等人2004)，尽管大多数血友病基因治疗的载体最初来自最普遍的AAV2血清型。基于AAV的基因疗法在治疗先天性失明上取得的首次临床成功突出地显示了这种基因转移技术的潜力(Bainbridge等人，2008)。在患有血友病的鼠和犬模型或非人类灵长类动物中用AAV载体进行的临床前研究表明，持续的治疗性表达导致血友病模型中出血表型的部分或完全的矫正(Snyder等人，1997，1999；Wang等人，1999，2000；Mount等人，2002；Nathwani等人，2002)。特别地，肝脏转导方便地诱导对FIX的免疫耐受，其需要调节性T细胞(Treg)的诱导(Mingozzi等人，2003；Dobrzynski等人，2006)。在用肝脏导向的AAV2-FIX基因疗法治疗的倾向于产生抑制剂的无效突变血友病B犬中实现了没有抑制剂产生的血友病表型的长期矫正(Mount等人，2002)。为了进一步减少载体剂量，已经开发了更有效的FIX表达盒。这可以通过使用更强的启动子/增强子元件、密码子优化的FIX或自互补双链AAV载体(scAAV)来实现，这些载体克服了AAV转导中的限制步骤之一(即单链向双链AAV转化)(McCarty，2001，2003；Nathwani等人，2002，2006，2011；Wu等人，2008)。可以使用替代的AAV血清型(例如AAV8或AAV5)，从而增加向肝细胞的转导，改善核内载体的导入，并可降低T细胞活化的风险(Gao等人，2002；Vandenberghe等人，2006)，尽管不确定这是否一定也会适用于人类受试者，因为表位在不同的AAV血清型之间是保守的(Mingozzi等人，2007)。与使用慢病毒载体相比，至少在小鼠中使用AAV8或AAV9对血友病B的肝脏定向基因疗法更有效，并且导致更少的炎症(VandenDriessche等人，2007，2002)。此外，研究表明表面暴露的酪氨酸残基的突变允许载体颗粒避本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码人白蛋白的密码子优化的核酸分子，其包含由SEQ ID NO:14定义的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的序列，优选由SEQ ID NO:14定义的序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181026 EP 18202888.61.一种编码人白蛋白的密码子优化的核酸分子，其包含由SEQIDNO:14定义的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的序列，优选由SEQIDNO:14定义的序列。


2.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含与SEQIDNO:14定义的所述序列或与SEQIDNO:14定义的所述序列具有至少80％序列同一性的所述序列融合的转基因，优选地，其中所述转基因是密码子优化的转基因，任选地，其中所述转基因位于SEQIDNO:14所定义的所述序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的所述序列的5’末端。


3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述转基因通过编码一个或多个多肽或肽接头的序列与由SEQIDNO:14定义的所述序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的所述序列分隔开，所述编码一个或多个多肽或肽接头的序列优选编码由SEQIDNO:18定义的肽接头。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其用于增加由转基因编码的蛋白质或多肽的表达和/或循环水平和/或活性。


5.一种核酸表达盒，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至启动子。


6.根据权利要求5所述的核酸表达盒，其包含
-至少一种组织特异性核酸调节元件，其可操作地连接至所述启动子和如权利要求1至3中任一项所定义的核酸分子；
-小鼠微小病毒(MVM)内含子，优选由SEQIDNO:20定义的MVM内含子；和/或
-转录终止信号，优选多腺苷酸化信号，更优选由SEQIDNO:21定义的合成的多腺苷酸化信号或SEQIDNO:23定义的猿猴病毒40(SV40)多腺苷酸化信号。


7.根据权利要求5或6中任一项所述的核酸表达盒，其中所述转基因编码分泌型治疗蛋白或分泌型免疫蛋白，优选地，所述转基因编码选自下列的分泌型治疗蛋白：因子IX、因子VII、因子VIIa、因子VIII、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、组织因子途径抑制剂(TFPI)、ADAMTS13、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PLGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、可溶性fms样酪氨酸激酶1(sFLT1)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、胰岛素、胰岛素原、因子X、血管性血友病因子、C1酯酶抑制剂(C1-INH)、溶酶体酶、溶酶体酶艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)、促红细胞生成素(EPO)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-8)、白介素9(IL-9)、白介素10(IL-10)、白介素11(IL-11)、白介素12(IL-12)、趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、afamin(AFM)、α1-抗胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、脂蛋白脂肪酶、载脂蛋白(apoliprotein)、低密度脂蛋白受体(LDL-R)、白蛋白、耐二肽基肽酶4(DPP-4)的胰高血糖素样肽1(GLP-1)、GLP-2、胰高血糖素、生长激素(GH)、干扰素(例如，IFNalpha-2b)、β-利尿钠肽、IL-1Ra、exendin-4、胃泌酸调节素、卵泡抑素、抗体和纳米抗体；优选地，其中所述转基因编码用于治疗和/或预防肝脏相关疾病的治疗性...

【专利技术属性】
技术研发人员：T范登德里斯奇，LK蔡，
申请(专利权)人：VRIJE布鲁塞尔大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE