微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及光纤传感器的生物传感技术领域，公开了微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的方法。本发明专利技术将标准血清预吸附到抗体修饰后的传感器上作为防污界面，以标准血清环境下的线性动态检测结果作为定标直线。然后提出以标准血清来降低人血清的个体差异影响对无标定量检测的影响。然后以标准血清的偏移量作为参考，获取得不同的人血清和标准人血清偏移量的偏差之后，根据定标曲线对人血清中的目标蛋白进行定量检测。OMC的定量检测结果与临床检测结果具有良好的一致。该策略填补了免疫传感器无标定量检测的空白，进一步的推进了微纳光纤耦合器生物传感器实用化。

【技术实现步骤摘要】
微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的方法
本专利技术涉及光纤传感器的生物传感
，具体的说是涉及微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的方法。
技术介绍
光纤微纳耦合器(OMC)传感器由于其成本低、结构简单、电磁干扰小、灵敏度高在生物传感领域得到了广泛的研究和应用。然而，在检测血清中目标蛋白时，往往存在非特异性吸附，增加背景噪声信号，阻碍检测，降低传感器性能。当免疫传感器表面功能修饰过程中出现缺陷或抗体没有完全覆盖传感器表面时，血清中的复杂的蛋白质会由于疏水性，静电和分子间交换相互作用吸附到传感器表面的空白位点上，并与传感器表面修饰的基团结合。在这些情况下，无标免疫传感器就需要将由非特异性吸附引起的响应与分析物与特定受体的结合引起的响应区分开来。此外，生物免疫传感器的实际应用需要准确定量检测临床血清样品中的待测目标蛋白。但是，在进行无标定量检测时，需要解决人血清的个体差异的问题。由于个体差异，不同的人类血清样品被注入到OMC中以反映不同的波长表达，基线是高度不确定的，很难使用某一血清透射光谱作为参考，这直接制约着生物传感器在临床样品的无标精准定量检测。金纳米颗粒，磁性纳米颗粒，二氧化硅颗粒，量子点等被用于标记在二抗上，以增强特异性结合信号，提高信噪比，从而忽略非特异性吸附的影响。然而，这些纳米材料的制备、功能化和三明治夹心免疫分析需要额外的时间、成本和操作程序。同时，传感器的性能可靠性也受到纳米粒子标记的不确定性影响。使用抗非特异性蛋白吸附材料作为表面涂层是传感器无标签免疫检测在血清中应用的主要策略。聚乙二醇和低聚乙二醇(PEG和OEG)材料是常见的选择，但它们在过渡金属离子和氧气存在下容易氧化，限制了生物传感器的长期应用。此外，已被证明具有良好防污性能的两性离子聚合物也是很好的候选材料。然而，合成此类材料的不足在于成本高、聚合步骤复杂，而且合成衍生物膜的方便性和高控制性仍然是一个挑战。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的方法，使得所述方法可以降低人血清的个体差异对无标定量检测的影响，保证后续目标蛋白OMC定量检测结果更准确、灵敏度高和特异性高。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的前置方法，包括：步骤1、对OMC进行表面功能化，将能够与目标蛋白的抗体偶联的活性基团固定在OMC上，然后使用化学试剂淬灭表面功能化OMC传感器表面剩余的活性基团；步骤2、设置不同浓度的被测标准血清，获取来源于不同人体的被测健康人血清(优选为20人及以上)，每个来源的被测健康人血清同样设置不同的浓度；采用浓度超过被测标准血清以及被测健康人血清浓度的标准血清封闭OMC传感器表面，然后清洗OMC传感器表面待用；选择其中一个浓度的被测标准血清进行OMC传感器检测，记录其波长信号的偏移量，计为A，所述偏移量为被测标准血清开始检测时波长信号和检测结束时的波长信号的差值(分两次测定)；按照同样的方法选择其中一个浓度的所有来源的被测健康血清检测波长信号偏移量，计为B1-BX，X为健康血清来源数量；对比偏移量A和偏移量B1-BX的相对波长偏移差的平均值以及标准偏差；通过本步骤上述检测，选择相对波长偏移差的平均值以及标准偏差最小的一组被测标准血清浓度a和被测健康血清浓度b，作为实际检测中采用的浓度；步骤3、清洗OMC传感器表面，然后以浓度为b的被测标准血清作为空白血清进行OMC传感器检测，当空白血清曲线重合后(如不重合可重复加入空白血清直至重合)，向浓度为b的被测标准血清中加入不同浓度的目标蛋白，配制成梯度浓度的目标蛋白标准检测液进行OMC传感器检测，获取定标曲线；步骤4、对OMC传感器表面进行解离、清洗，待用。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术以sigma人血清作为标准血清；作为优选，所述活性基团选择羧基或醛基；在本专利技术具体实施方式中，本专利技术选择羧基，通过NHS和EDC活化后连接目标蛋白的抗体，所述羧基由PAA提供；同时，本专利技术使用乙醇胺来淬灭多余的羧基或醛基，具体是采用1M乙醇胺-HCl(pH＝8.5)淬灭。作为优选，步骤1所述活性基团固定在OMC上采用静电吸附或共价键连接的方式进行固定。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术采用静电吸附方式进行固定，先通过氢氧化钾是OMC表面带负电荷，然后通过PDDA的正电解质溶液吸附，最后通过PAA的负电解质溶液静电吸附并由其提供活性基团-羧基。本专利技术步骤2为人血清个体差异校正，通过该步骤以某一浓度的标准血清的偏移量涵盖绝大多数的临床血清的偏移量，校正个体差异，使检测更加准确。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术选择25％和30％两个浓度的标准血清，与23份25％浓度的健康人血清样本的波长偏移量进行对比，结果显示，在相同的波长附近，25％标准血清波长偏移与23份浓度为25％的健康人血清样品的波长偏移对比结果为：相对波长偏移差的平均值为0.64nm，标准偏差为0.42nm；30％标准血清波长偏移与23份浓度为25％的健康人血清样品的波长偏移对比结果为：相对波长偏移差平均值为0.08nm，标准偏差为0.27nm。实验结果表明对于25％浓度的临床血清样本检测，30％标准血清比25％标准血清更适合作为参考以减少血清个体差异对无标定量检测的影响。因此，本专利技术确定以sigma人血清作为标准血清，浓度为30％，将临床血清检测时的浓度确定为25％。其中，血清浓度通过PBS稀释调整。在本专利技术具体实施方式中，封闭OMC传感器表面的标准血清浓度为50％。由于一个传感器往往无法覆盖整个测量范围，因此在本专利技术具体实施方式中使用不同线性动态范围的OMC免疫传感器检测标准血清中不同浓度的目标蛋白，得到定标曲线。例如本专利技术实施例提供的标准血清中目标蛋白与OMC表面固定的目标蛋白的抗体在200fg/mL-1pg/mL范围内的线性反应，200pg/mL-800pg/mL范围内的线性反应，以及2ng/mL-8ng/mL浓度范围内的线性反应；通过三个不同线性动态范围的OMC免疫传感器检测标准血清中不同浓度的目标蛋白。通过上述前置方法，本专利技术将检测过程中可能的非特异性吸附以及个体差异均进行了校正，可以保证后续检测更准确、灵敏度高和特异性高。同时，本专利技术还提供了微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的方法，在所述前置方法的基础上继续进行如下步骤：将浓度为a的被测标准血清进行OMC传感器检测，记录刚开始检测时的波长信号fs1以及检测完成时的波长信号fs2，偏移量计为fs2-fs1；将临床待测血清的浓度调节为权利要求1中的浓度b，进行OMC传感器检测，记录刚开始检测时的波长信号fp1以及检测完成时的波长信号fp2；根据公式(fp2-fp1)-(fs2-fs1)获得临床待测血清的波长信号，代入到前述的定标曲线中，获得临床待测血清中目标蛋白的含量。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的前置方法，其特征在于，包括：/n步骤1、对OMC进行表面功能化，将能够与目标蛋白的抗体偶联的活性基团固定在OMC上，然后使用化学试剂淬灭表面功能化OMC传感器表面剩余的活性基团；/n步骤2、设置不同浓度的被测标准血清，获取来源于不同人体的被测健康人血清，每个来源的被测健康人血清同样设置不同的浓度；采用浓度超过被测标准血清以及被测健康人血清浓度的标准血清封闭OMC传感器表面，然后清洗OMC传感器表面待用；/n选择其中一个浓度的被测标准血清进行OMC传感器检测，记录其波长信号的偏移量，计为A，所述偏移量为被测标准血清开始检测时波长信号和检测结束时的波长信号的差值；按照同样的方法选择其中一个浓度的所有来源的被测健康血清检测波长信号偏移量，计为B

【技术特征摘要】
1.微纳光纤耦合器无标生物传感定量检测血清中目标蛋白的前置方法，其特征在于，包括：
步骤1、对OMC进行表面功能化，将能够与目标蛋白的抗体偶联的活性基团固定在OMC上，然后使用化学试剂淬灭表面功能化OMC传感器表面剩余的活性基团；
步骤2、设置不同浓度的被测标准血清，获取来源于不同人体的被测健康人血清，每个来源的被测健康人血清同样设置不同的浓度；采用浓度超过被测标准血清以及被测健康人血清浓度的标准血清封闭OMC传感器表面，然后清洗OMC传感器表面待用；
选择其中一个浓度的被测标准血清进行OMC传感器检测，记录其波长信号的偏移量，计为A，所述偏移量为被测标准血清开始检测时波长信号和检测结束时的波长信号的差值；按照同样的方法选择其中一个浓度的所有来源的被测健康血清检测波长信号偏移量，计为B1-BX，X为健康血清来源数量；对比偏移量A和偏移量B1-BX的相对波长偏移差的平均值以及标准偏差；
通过本步骤上述检测，选择相对波长偏移差的平均值以及标准偏差最小的一组被测标准血清浓度a和被测健康血清浓度b，作为实际检测中采用的浓度；
步骤3、清洗OMC传感器表面，然后以浓度为b的被测标准血清作为空白血清进行OMC传感器检测，当空白血清曲线重合后，向浓度为b的被测标准血清中加入不同浓度的目标蛋白，配制成梯度浓度的目标...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴一辉，周文超，韦友莲，徐阳，刘永顺，
申请(专利权)人：广东长光中科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44