表面活化的荧光乳胶微球的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：将表面修饰羟基的荧光乳胶微球分散，加入催化剂，搅拌至溶解，加入环氧氯丙烷并搅拌；加入碱并搅拌，清洗，得到表面活化的荧光乳胶微球。本发明专利技术通过对羟基改性得到表面有环氧基团修饰的荧光乳胶微球，此表面活化的微球可一步结合抗体，简化了偶联工艺，在抗体偶联中显示出较高的反应活性。

【技术实现步骤摘要】
表面活化的荧光乳胶微球的制备方法及应用
本专利技术涉及高分子材料
，尤其涉及一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法及应用。
技术介绍
乳胶微球是由高聚合材料合成的纳米级球形的标记材料，根据表面官能团的不同可分为羧基化、氨基化、巯基化乳胶微球，还可以包裹不同颜色染料，使其颜色丰富，可满足多种实验的要求。因其稳定性问题，在使用之前，微球表面是未经活化的，没有吸附或化学胶连能力，使用时必须先经活化处理，荧光乳胶微球才能借助于微球表面丰富的功能基团(如羧基、氨基等)与抗体或者抗原共价结合，进而捕获相应的待测物，之后通过荧光信号的强弱实现相应生物分子的定量检测。微球与抗原/抗体共价结合常采用的偶联方法为EDC/NHS法。首先使用水溶性的碳二亚胺EDC对微球上的羧基官能团进行活化生成活性酯中间体，该活性酯中间体可直接与含氨基的生物分子高效结合，从而将生物分子偶联到微球表面。但由EDC反应形成的活性酯中间体稳定性较差，容易水解，可通过引入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成另一更稳定的活性酯中间体，与氨基发生取代反应形成酰胺键，较大提高生物分子的结合效率。但在活化偶联工艺中，活化完成后需要对试剂进行洗脱处理，大致流程为活化、离心、洗涤、分散、加入蛋白结合、配成试剂，这个过程中还是存在很多不稳定的情况，如微球团聚、活化效果差、偶联效率低，如何更高效稳定地进行微球和生物分子的结合成为乳胶微球生物应用中亟待解决的关键问题。CN1246351C公开了一种环氧功能型交联核壳结构纳米高分子微球，在乳化剂和引发剂存在的条件下通过以水为介质的乳液或悬浮聚合得到了具有核壳结构、纳米尺度、表面带有环氧官能团的高分子微球；CN103386282B采用带环氧基的硅烷偶联剂得到表面环氧基活化的磁性微球，但构建方式均较为复杂。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术通过对羟基改性得到表面有环氧基团修饰的荧光乳胶微球，此表面活化的微球可一步结合抗体，简化了偶联工艺，因此避免了传统活化偶联工艺中出现的微球团聚、活化效果差和偶联效率低的问题。本专利技术的一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：(1)将表面修饰羟基的荧光乳胶微球分散，加入催化剂，搅拌至溶解，加入环氧氯丙烷并搅拌；(2)向步骤(1)的混合溶液中加入碱并搅拌，清洗，得到表面活化的荧光乳胶微球。本专利技术在催化剂作用下，环氧氯丙烷上的环氧基与微球表面的羟基反应开环，使开环后的环氧氯丙烷接枝到羟基微球表面，之后在碱性条件下脱氯化氢、闭环，得到环氧基表面的微球。环氧基活化的微球与生物分子的共价连接不需要其他活化剂的加入，同时，两步反应提高了微球表面羟基的反应效率，保证后续环氧基团的高得率。两步反应如下所示：进一步地，表面修饰羟基的荧光乳胶微球、催化剂、环氧氯丙烷和碱的质量比为1:0.01-0.1:0.1-10:0.1-10。进一步地，环氧氯丙烷和碱的质量比为1:1-1.1。此质量比的目的是，经闭环得到的环氧基不会在过高碱溶液存在下发生碱性开环，从而保证环氧基的得率。进一步地，在步骤(1)中，荧光乳胶微球选自含有荧光的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球中的一种或多种，尺寸为100-1000nm。进一步地，在步骤(1)中，催化剂为Lewis酸。进一步地，Lewis酸选自三氯化铝、三氟化硼或三氟甲烷磺酸中的一种或多种。进一步地，在步骤(1)中，加入催化剂后，在50-90℃下搅拌反应10-20h。进一步地，在步骤(1)中，环氧氯丙烷的滴加时间为0.5-2h。进一步地，在步骤(2)中，碱选自氢氧化钠、氢氧化钾和四甲基氢氧化铵中的一种或多种。进一步地，在步骤(2)中，加入碱后，在40-60℃下搅拌反应2-4h。进一步地，在步骤(2)中，依次用去离子水和无水乙醇采用离心方式清洗。进一步地，在步骤(2)中，清洗之后还包括烘干的步骤。本专利技术要求保护上述制备方法制备的表面活化的荧光乳胶微球。本专利技术还要求保护上述制备方法制备的表面活化的荧光乳胶微球在生物偶联中的应用。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：(1)本专利技术通过小分子环氧化物对微球的表面羟基进行改性得到表面环氧基活化的荧光乳胶微球，极大地简化了微球偶联生物分子的工艺流程，可重复性强，偶联过程更稳定可控。(2)本专利技术活化后的微球可直接与含胺基、巯基等的抗体、蛋白、氨基酸等配体分子反应。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细附图说明如后。附图说明为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中图1为实施例1制备的荧光乳胶微球的抗体偶联检测结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1取表面羟基荧光乳胶微球1.0g(聚苯乙烯材质，微球尺寸为100nm)分散于去离子水中，向其中加入三氯化铝0.1g，搅拌使其溶解，称取环氧氯丙烷10.0g，缓慢滴加1h，80℃下搅拌反应20h后，将反应液冷却至50℃，向其中加入氢氧化钠4.5g，50℃下搅拌反应2h；待反应液冷却至室温，依次用去离子水、无水乙醇清洗，烘干得到表面活化的荧光乳胶微球。实施例2取表面羟基荧光乳胶微球1.0g(聚甲基丙烯酸甲酯材质，微球尺寸为500nm)分散于去离子水中，向其中加入三氟化硼0.1g，搅拌使其溶解，称取环氧氯丙烷4.0g，缓慢滴加0.5h，70℃下搅拌反应15h，将反应液冷却至50℃，向其中加入氢氧化钾1.8g，50℃下搅拌反应3h；待反应液冷却至室温，依次用去离子水、无水乙醇清洗，烘干得到表面活化的荧光乳胶微球。抗体偶联测试：称取实施例1制备得到的表面活化的荧光乳胶微球粉末100mg，超声分散于10mL碳酸钠缓冲液(0.1M，pH10)，向其中加入C反应蛋白多克隆抗体(0.1ml，2mg/ml)，充分混匀后于37℃下过夜孵育；加入半胱氨酸，继续孵育2h，用碳酸钠缓冲液清洗三次，最终分散于100mL碳酸钠缓冲液中，得到表面偶联C反应蛋白多克隆抗体的荧光微球。以得到的表面偶联C反应蛋白多克隆抗体的荧光微球为固相载体制备C反应蛋白检测试纸条，在制备好的C反应蛋白试纸条的加样区分别加入一系列不同浓度的C反应蛋白标准品(0、0.625、1.25、2.5、5、10mg/L)，滴加缓冲液，10min后，用荧光定量免疫分析仪读取试纸条上T线的信号值，结果见表1。对表1所得信号平均值进行数据处理，得到坐标曲线，如图1所示。表1不同浓度标准品检测结果由图可见，本专利技术制备的荧光乳胶微球用于C反应蛋白抗体偶联时，T线信号值随待本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将表面修饰羟基的荧光乳胶微球分散，加入催化剂，搅拌至溶解，加入环氧氯丙烷并搅拌；/n(2)向步骤(1)的混合溶液中加入碱并搅拌，清洗，得到表面活化的荧光乳胶微球。/n

【技术特征摘要】
1.一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将表面修饰羟基的荧光乳胶微球分散，加入催化剂，搅拌至溶解，加入环氧氯丙烷并搅拌；
(2)向步骤(1)的混合溶液中加入碱并搅拌，清洗，得到表面活化的荧光乳胶微球。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表面修饰羟基的荧光乳胶微球、催化剂、环氧氯丙烷和碱的质量比为1:0.01-0.1:0.1-10:0.1-10。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述环氧氯丙烷和碱的质量比为1:1-1.1。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述荧光乳胶微球选自含有荧光的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球中...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋孟杰，刘照关，
申请(专利权)人：苏州为度生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32