枇杷花发育相关的EjAP2L基因及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷开花时间和花器官发育的转录因子EjAP2L基因及其应用。EjAP2L基因cDNA的编码区序列全长如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的EjAP2L基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核，具有典型的AP2转录因子基因的亚细胞定位特性。将EjAP2L基因过表达载体转入野生型拟南芥中进行过量表达，能显著促进拟南芥开花时间，并在部分转基因植株中改变拟南芥的花瓣结构和数目。因此，本发明专利技术的枇杷EjAP2L可用于植物早花早熟、多瓣品种的定向选育，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
枇杷花发育相关的EjAP2L基因及其编码蛋白与应用
本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjAP2L蛋白及其编码基因和应用。
技术介绍
枇杷是起源于我国的重要亚热带常绿果树，目前已广泛分布在日本、印度、巴基斯坦、西班牙、意大利、美国、巴西、南非等30多个国家，成为一种世界范围的重要果树。由于枇杷鲜美多汁、营养价值极高，同时价格较高，在推动我国农村产业结构调整中起着重要作用。在枇杷生产过程中，花果发育是一个连续的过程，早花品种通常也是果实早熟品种，特别是早花早熟品种往往可以在销售市场上抢占先机，因此选育早花早果新品种对枇杷产业发展具有重要作用：一方面可以提前上市时间，有效拓宽枇杷货架期；另一方面可以提高枇杷的生产效益，达到增收的效果。在拟南芥中，APETALA2(AP2)基因编码AP2/EREBP转录因子，在调控花发育网络调控过程中扮演重要角色，包括营养生长向花分生组织生长的转变、花器官发育等方面。在花发育基因调控网络中，AP2不仅可以促进WUSCHEL(WUS)基因的表达，调控花芽分化，而且AP2还与AG基因相互拮抗，进而调控萼片和花瓣的发育。但是，AP2基因的功能研究仅限于模式植物拟南芥，主要农作物水稻、大麦，重要观赏花卉植物。但是多年生木本植物AP2-like基因的功能鉴定及作用机制一直未见报道，其是否参与调控功能尚不清楚。因此，开展多年生木本植物，特别是果树中的AP2-like基因序列、表达和功能进行分析，对拓宽AP2-like基因的认知具有重要作用。本专利技术对枇杷AP2-like基因EjAP2L的分子调控机制和应用进行研究，有助于综合了解多年生蔷薇科植物的花发育过程，并为枇杷早花早熟品种的定向选育提供有价值且可利用的基因资源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供枇杷EjAP2L蛋白及其编码基因与应用。首先，本专利技术提供枇杷EjAP2L蛋白，其为：1)由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本专利技术还提供编码所述的枇杷EjAP2L蛋白的基因。所述基因的序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。本专利技术还提供所述基因在调控被子植物开花时间和花器官中的用途。本专利技术从枇杷花芽中分离了一个枇杷花发育调控密切相关的AP2-like基因EjAP2L，发现其定位于细胞核，表明该基因编码蛋白属于典型的AP2转录因子基因的亚细胞定位特性。通过半定量PCR证实了EjAP2L基因在枇杷不同器官中均有表达，但在成花转变、花器官和幼果中的表达量较高。实时荧光定量PCR证实了EjAP2L基因在花芽生理分化期和花序支轴分化期的表达量较高，表明EjAP2L基因的表达量具有促进枇杷花芽分化时间的作用。利用基因工程手段构建了EjAP2L基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能显著促进拟南芥开花时间，并在部分转基因植株中改变拟南芥的花瓣结构和数目。本专利技术为被子植物开花时间和花器官的改造提供了很好的应用前景。附图说明图1是实施例1枇杷EjAP2L基因的核心序列、3'RACE、5'RACE和基因编码区序列验证的电泳照片。其中，A是核心序列克隆的电泳照片，M为DL2000DNAmarker，EjAP2L1为EjAP2L基因的核心序列PCR产物；B是5'RACE的电泳照片，M为DL2000DNAmarker，5R为5'RACE的PCR产物；C是3'RACE的电泳照片，M为DL2000DNAmarker，3R为3'RACE的PCR产物；D为EjAP2L基因ORF验证的PCR电泳照片，M为DL2000DNAmarker，FEjAP2L为EjAP2L基因ORF的PCR产物；箭头指示为PCR扩增的目的基因条带。图2是枇杷花发育相关的EjAP2L蛋白氨基酸序列比对图。A是枇杷(EjAP2L)、拟南芥(AtAP2)、月季(RcAP2)、毛白杨(PtAP2)和大豆(GsAP2)的AP2同源蛋白质序列对比率；B是EjAP2L、AtAP2、RcAP2、PtAP2和GsAP2的AP2同源蛋白质序列的整体对比，·代表氨基酸序列相同，-代表氨基酸序列缺失。图3是实施例2枇杷EjAP2L基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP，DAPI和BF的合并后的图像。图4是实施例3枇杷EjAP2L基因在枇杷不同器官的半定量PCR分析。a：茎；b：叶；c：叶芽；d：萼片；e：花瓣；f：花药；g：花丝；h：花柱；i：子房；j：幼果。图5是实施例4枇杷EjAP2L基因在枇杷花芽不同发育时期的表达量变化。其中横坐标代表花发育时期：S1.花芽的生理分化期；S2.花芽形态分化期；S3.花序主轴分化期；S4.花序支轴分化期；S5.花序侧生支轴快速伸长期；S6.小花分化期；S7.花蕾露白期；S8.盛花期。图6是实施例7枇杷EjAP2L拟南芥阳性苗的PCR产物鉴定。M为DL2000DNAmarker，1-23是转EjAP2L基因拟南芥植株，n1是模板为ddH2O的PCR产物阴性对照，n2是模板为未转基因拟南芥DNA的PCR产物阴性对照，P1是模板为pFGC5941-EjAP2L质粒的PCR产物阳性对照。图7是实施例7转EjAP2L基因前后的野生型拟南芥的开花时间分析。其中，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjAP2L基因能导致转基因拟南芥开花时间提前15天左右。图8是实施例7转基因拟南芥的花器官对比分析。其中，A是未转基因拟南芥的花器官；B是转EjAP2L基因拟南芥的花器官。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1枇杷EjAP2L基因cDNA序列的克隆枇杷花芽总RNA的提取采集新鲜长度约0.5cm的枇杷花芽，迅速取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用。采用RNA提取试剂盒提取枇杷花芽中的总RNA：从-80℃超低温冰箱中取出收集的花芽材料，放入预先冷冻并且加有1mLRLT裂解液和100μLPLANTaid的研钵中，在室温条件下，充分研磨；将上述研磨液转移至2.0mL的离心管中，12000rpm离心15min后，吸取600μL上清液，转移至新的2.0mL离心管；向上清液中加入300μL无水酒精，吸打混匀后，加入吸附柱中，然后将吸附柱放入收集管，13000rpm离心，1min后倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.枇杷EjAP2L蛋白，其为：/n1)由SEQ EjEjAP2L ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或/n2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.枇杷EjAP2L蛋白，其为：
1)由SEQEjEjAP2LIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
2)在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。


2.编码权利要求1所述蛋白的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQIDNo.1所示。


4.含有权利要求2或3所述基因的载体。


5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。


6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。


7.权利要求2或3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：景丹龙，刘新亚，蒲籽言，石敏，梁国鲁，郭启高，何桥，王淑明，党江波，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50