一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄嘌呤氧化酶抑制肽，其氨基酸序列为Glu‑Glu‑Lys(EEK)。本发明专利技术所提供的一种黄嘌呤氧化酶抑制三肽EEK能与黄嘌呤氧化酶有效结合，对黄嘌呤氧化酶具有持续稳定的抑制效果。三肽EEK对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC

【技术实现步骤摘要】
一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其应用
本专利技术属于生物活性肽领域，具体涉及一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其应用。
技术介绍
尿酸是人体嘌呤代谢的最终产物。尿酸的过量产生和排泄受阻将导致高尿酸血症。近年来，随着高嘌呤食物摄入量的增加，高尿酸血症的患病率呈上升趋势。高尿酸血症的长期积累会导致痛风。痛风给人体带来剧烈性疼痛，同时，痛风还会引起高血压、心血管疾病等并发症。尿酸性肾病也与痛风有关。黄嘌呤氧化酶是一种肝酶，催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，随后黄嘌呤氧化为尿酸。因此，黄嘌呤氧化酶是痛风治疗药物研发的重要分子靶点。黄嘌呤氧化酶抑制剂(别嘌呤醇和非布索坦)广泛应用于痛风的治疗。然而，许多黄嘌呤氧化酶抑制剂对痛风急性发作的治疗效果不佳，甚至有一定的副作用。例如：别嘌呤醇常用于治疗间歇性或慢性痛风，但对痛风急性发作无作用。非布索坦是比别嘌呤醇更有效的黄嘌呤氧化酶抑制剂，但其可能导致肝功能异常，引发急性心血管疾病。与化学分子相比，食源性生物活性肽具有易吸收、无毒、生物活性高、特异性高、渗透性高等优点。因此，从食品中鉴定黄嘌呤氧化酶抑制剂已成为治疗痛风的主要方法。中国专利技术专利公开了一种从金枪鱼蛋白中鉴定出来的黄嘌呤氧化酶抑制肽EEAK，其对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为0.58mg/mL(公开号CN111925412A，申请日期2020.09.09)。蛋清蛋白是一种优质的生物活性肽源。蛋清蛋白衍生肽已被证明具有降压活性、抗菌活性、抗氧化活性、抗癌活性、免疫调节活性和抗黏附特性。此外，鸡蛋作为原料更为便宜也更容易获得。<br>因此，本专利技术旨在提供一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其在制备抗通风药品中的应用，以降低黄嘌呤氧化酶活性从而达到控制和治疗痛风的目的，或作为功能性食品添加剂，供痛风患者长期保健治疗。
技术实现思路
本专利技术公开了一种黄嘌呤氧化酶抑制肽，其氨基酸序列为Glu-Glu-Lys(EEK)。本专利技术的黄嘌呤氧化酶抑制肽具有良好的黄嘌呤氧化酶抑制效果，对黄嘌呤氧化酶的半抑制浓度(IC50)为0.40mg/mL。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：(1)虚拟胃肠道酶解本专利技术选用胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶通过ExPASyPeptideCutter对蛋清中的卵清蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶序列进行模拟酶切，获得三肽、四肽和五肽。(2)水溶性、毒性的预测。通过在线工具peptidepropertycalculator对上述多肽序列进行水溶性预测。通过DiscoveryStudio2017软件的毒性预测功能对上述多肽的Ames致突变性、发育毒性和皮肤致敏性进行预测，筛选得到无毒、水溶性好的多肽。(3)靶向筛选从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得黄嘌呤氧化酶的晶体结构(PDBID：3NVY)，并将其作为蛋白靶标。以‘CDOCKER-ENERGY’数值为指标，得分越低表示多肽与黄嘌呤氧化酶结合的亲和力和稳定性越高，筛选得到具有潜在黄嘌呤氧化酶抑制活性的三肽EEK。(4)体外黄嘌呤氧化酶抑制活性测定通过高效液相色谱法对三肽EEK的黄嘌呤氧化酶体外抑制活性进行验证。方法原理为：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生尿酸，具体操作为：采用高效液相色谱法对反应前后黄嘌呤的含量进行测定，进而对三肽EEK的黄嘌呤氧化酶抑制活性进行测定。取黄嘌呤氧化酶溶液30μL(0.025U/ml)加10μL三肽EEK混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热10min，然后加30μL(5mmol/L)黄嘌呤储备液充分混合，37℃条件下反应20min后进行测定。同时用磷酸钠(pH7.4)缓冲液分别替代抑制剂溶液和抑制剂、黄嘌呤氧化酶溶液作为空白对照组，该反应液直接用HPLC系统进行分析。色谱条件：柱温31℃，流速0.5mL/min，进样量10μL，流动相为水-TFA(0.5％)∶甲醇＝97∶3等度洗脱，检测波长254nm。利用下列公式计算不同浓度三肽EEK的抑制率：黄嘌呤氧化酶抑制活性(％)＝(A-B)/(C-B)×100％其中A是黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤和酶促肽样品存在时反应的峰面积；B是相同体积的酶促肽样品被缓冲溶液替代所测得的峰面积；C是相同体积的酶促肽样品和黄嘌呤氧化酶被缓冲液替代测得的峰面积。IC50值定义为：在测定条件下抑制50％黄嘌呤氧化酶活性的抑制剂浓度。结果显示EEK具有良好黄嘌呤氧化酶抑制活性，IC50值为0.40mg/mL。(5)应用本专利技术的一种黄嘌呤氧化酶抑制肽，其获得可利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对鸡蛋的卵清蛋白进行酶解并通过多维色谱纯化(凝胶过滤色谱、亲和色谱和半制备液相色谱)实现；也可通过固相化学合成方法实现。本专利技术的一种黄嘌呤氧化酶抑制肽EEK，其形态没有特别限定。例如，通过溶于水制成液剂，通过喷雾干燥制成粉末状或颗粒状，通过冷冻干燥或加热干燥制成固形剂来使用。黄嘌呤氧化酶活性的定义：黄嘌呤氧化酶活性的一个单位(U)定义为在37℃下每分钟催化黄嘌呤形成1mol的尿酸所需的酶量。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：(1)本专利技术首次从卵清蛋白中筛选出一种对黄嘌呤氧化酶具有显著抑制活性的三肽EEK，明确了三肽EEK的结构，且提高了鸡蛋的附加值。(2)上述三肽EEK作为功能成分用于具有治疗痛风药品中，或作为功能性食品添加剂，供痛风患者长期保健治疗，具有良好的潜力和应用前景。附图说明本专利技术附图2幅，其中：图1肽EEK与黄嘌呤氧化酶的对接结果2D图；图2肽EEK与黄嘌呤氧化酶的对接结果3D图；具体实施方式下面以具体实施例的方式对本专利技术作进一步的阐述。实施例1.黄嘌呤氧化酶抑制肽的靶向筛选(1)虚拟胃肠道酶解通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载卵清蛋白(AccessionofNCBI：AAB59956)、卵类粘蛋白(AccessionofNCBI：ACJ0.4729和XP_0.212665.64)、溶菌酶(AccessionofNCBI：AAB31830)序列。选用胃蛋白酶(EC3.4.23.1)，胰蛋白酶(EC3.4.21.4)和胰凝乳蛋白(EC3.4.21.1)通过ExPASyPeptideCutter程序(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)对上述蛋白进行酶解。获得62条三肽、四肽和五肽(如图1)。图1.虚拟酶解获得多肽结果(2)水溶性、毒性的预测。通过在线工具peptidepropertycalculator(http：//www.innovagen.com/)对62条活性肽进行水溶性预测。通过DiscoveryStudio2017软件的毒性预测功能对上述多肽的Ames致突变性、发育毒性和皮肤致敏性进行预测，毒性预测结果表明，所有多肽均无突本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备抗通风药品中的应用，所述黄嘌呤氧化酶抑制肽的氨基酸序列为Glu-Glu-Lys(EEK)。/n

【技术特征摘要】
1.一种黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备抗通风药品中的应用，所述黄嘌...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志鹏，曹雅欣，赵文竹，纪慧卓，
申请(专利权)人：渤海大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21