鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法及应用，黄河鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法包括鲤TLR2基因开放阅读框的克隆；鲤TLR2基因重组表达载体pET

Preparation and application of polyclonal antibody against toll like receptor 2 in common carp

【技术实现步骤摘要】
鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种鲤Toll样受体2（Toll
‑
Like Receptor 2，TLR2）多克隆抗体的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]Toll基因由Nusslein
‑
Volhard及其团队于1980年在进行果蝇相关研究的过程中被发现，并为其命名。研究显示，该受体在抗细菌、真菌等病原体中发挥着不可替代的作用，并且参与转导了抗菌感染易感性信号。Toll样受体2（Toll
‑
Like Receptor 2，TLR2是TLR家族中不可或缺的一份子，在先天性免疫中具有无可替代的地位。目前已探明的TLR2介导的生物学效应主要为参与细胞活化、吞噬作用等方面，此外TLR2也能够促进树突状细胞成熟，在多种组织中均有表达。
[0003]在哺乳类中，TLR2能够同众多配体广泛结合。TLR2通过识别配体的方式激活MyD88依赖型信号路径，从而分泌多种细胞因子。此外，有实验表明TLR2能够与TLR1和TLR6形成异二聚体，该二聚体能对菌体成分进行识别，从而激活信号转导，发挥免疫应答作用。
[0004]鲤是我国主要的经济淡水鱼类，在我国具有较大的养殖规模。然而，在养殖过程中细菌性疾病已成为制约鲤养殖业进一步发展的限制因素。因此，深入研究鲤的免疫机制，有助于建立提高鲤机体免疫的方法，对鲤养殖业的健康发展具有重要意义。哺乳动物的研究中，关于Toll样受体大多是蛋白水平的检测。由于水产上缺少相应的抗体，致使在目前的探究实验中水产动物在Toll样受体的检测大部分局限于mRNA水平，限制了进一步的深入研究。
[0005]为了解决这一技术问题，从鲤中克隆获得TLR2基因，通过原核表达和免疫小鼠的方法制备鲤TLR2多克隆抗体，通过免疫组化实验，对该多克隆抗体的特异性进行检验，并分析其在肠道中的表达情况，对进一步研究TLR2在宿主肠道中的免疫功能具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术解决的技术问题是提供了一种鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法及应用，该方法制备的鲤TLR2多克隆抗体能够用于（荧光）免疫组化、蛋白印迹和酶联免疫吸附等实验要求，建立体外免疫分析、研究鲤TLR2的功能以及鲤免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于其他鲤科鱼类TLR2的免疫检测。
[0007]本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤S1：鲤TLR2基因开放阅读框的克隆提取鲤肠组织总RNA，经1.0wt%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并在260 nm和280nm处分别用吸光度法测定其纯度和含量，吸收比接近2.0的样品随后用M
‑
MLV反转录酶合成cDNA第一链，于
‑
80℃保存备用，再根据GenBank数据库中已报道的TLR2基因序列设计第一对特异性引物TLR2
‑
ORF
‑
F和TLR2
‑
ORF
‑
R，进行PCR扩增获得鲤TLR2基因开放阅读框片
段；步骤S2：鲤TLR2基因重组表达载体的构建根据鲤TLR2基因全长cDNA序列设计第二对特异性引物TLR2
‑
YHBD
‑
F和TLR2
‑
YHBD
‑
R，分别在上、下游引物添加了BamH I和Hind III酶切位点，再以鲤cDNA为模板，TLR2
‑
YHBD
‑
F和TLR2
‑
YHBD
‑
R分别为上、下游引物，进行PCR扩增，将PCR产物经胶回收后和pET
‑
32a(+)表达载体进行双酶切，胶回收纯化，经T4酶连接后转入克隆感受态DH5α，获得重组表达载体pET
‑
32a(+)
‑
TLR2；步骤S3：鲤TLR2重组蛋白的诱导表达、纯化及Western Blot特异性分析将步骤S2得到的重组表达载体pET
‑
32a(+)
‑
TLR2转入表达感受态BL21(DE3)，在含有氨苄抗性的LB培养液中于37℃培养至OD值为0.5
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导培养，经离心收集菌体、PBS重悬后加入5
×
上样缓冲液沸水浴10 min，经12wt% SDS
‑
PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，并做相应的对照组；以1wt%的接种量将能表达重组蛋白的菌液添加到含有氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养，于37℃培养至OD值为0.5
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导培养，将诱导培养好的菌液离心，收集菌体用变性结合缓冲液冲悬浮后采用超声波破碎的方法获得融合蛋白的包涵体，借助变性洗脱缓冲液通过His Trap HP柱对融合蛋白进行纯化，并用透析方法去除融合蛋白溶液中的CH4N2O和C3H4N2等盐离子，获得纯化的鲤TLR2重组蛋白；步骤S4：鲤TLR2多克隆抗体的制备将步骤S3纯化的鲤TLR2重组蛋白作为抗原，蛋白质浓度用0.85wt%的生理盐水调整为500 μg/mL后对小鼠进行5次免疫，按体积比1:1的比例加入弗氏完全佐剂，采用腹部皮下多点注射，每隔1周加强免疫1次，共免疫5次，加强免疫选用弗氏不完全佐剂，末次免疫10天后进行全血分离，收集鼠抗血清，纯化得到鲤Toll样受体2多克隆抗体。
[0008]进一步限定，步骤S1中所述第一对特异性引物为：上游引物名称为TLR2
‑
ORF
‑
F；引物序列为5
´
‑
ATGCAATTCTTGGGAAGAG
‑3´
；下游引物名称为TLR2
‑
ORF
‑
R；引物序列为5
´
‑
TCAACATTCATCTCTCTGTAGAG
‑3´
。
[0009]进一步限定，步骤S1中所述第一对特异性引物进行PCR扩增时，每25 μL的PCR扩增的反应体系包括ddH2O 9.5 μL、Premix TaqTM 12.5 μL、TLR2
‑
ORF
‑
F 1.0 μL、TLR2
‑
ORF
‑
R 1.0 μL和cDNA 1.0 μL；所述第一对特异性引物进行PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性5 min；35次循环中包括94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸3 min；最后72℃延伸10 min。
[0010]进一步限定，步骤S2中所述第二对特异性引物为：上游引物名称为：TLR2
‑
YHBD
‑
F；引物序列为5
´
‑
CGGGATCCTCAAATCATCTCCAACAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤S1：鲤TLR2基因开放阅读框的克隆提取鲤肠组织总RNA，经1.0wt%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并在260 nm和280nm处分别用吸光度法测定其纯度和含量，吸收比接近2.0的样品随后用M
‑
MLV反转录酶合成cDNA第一链，于
‑
80℃保存备用，再根据GenBank数据库中已报道的TLR2基因序列设计第一对特异性引物TLR2
‑
ORF
‑
F和TLR2
‑
ORF
‑
R，进行PCR扩增获得鲤TLR2基因开放阅读框片段；步骤S2：鲤TLR2基因重组表达载体的构建根据鲤TLR2基因全长cDNA序列设计第二对特异性引物TLR2
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YHBD
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F和TLR2
‑
YHBD
‑
R，分别在上、下游引物添加了BamH I和Hind III酶切位点，再以鲤cDNA为模板，TLR2
‑
YHBD
‑
F和TLR2
‑
YHBD
‑
R分别为上、下游引物，进行PCR扩增，将PCR产物经胶回收后和pET
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32a(+)表达载体进行双酶切，胶回收纯化，经T4酶连接后转入克隆感受态DH5α，获得重组表达载体pET
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32a(+)
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TLR2；步骤S3：鲤TLR2重组蛋白的诱导表达、纯化及Western Blot特异性分析将步骤S2得到的重组表达载体pET
‑
32a(+)
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TLR2转入表达感受态BL21(DE3)，在含有氨苄抗性的LB培养液中于37℃培养至OD值为0.5
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导培养，经离心收集菌体、PBS重悬后加入5
×
上样缓冲液沸水浴10 min，经12wt% SDS
‑
PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，并做相应的对照组；以1wt%的接种量将能表达重组蛋白的菌液添加到含有氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养，于37℃培养至OD值为0.5
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导培养，将诱导培养好的菌液离心，收集菌体用变性结合缓冲液冲悬浮后采用超声波破碎的方法获得融合蛋白的包涵体，借助变性洗脱缓冲液通过His Trap HP柱对融合蛋白进行纯化，并用透析方法去除融合蛋白溶液中的CH4N2O和C3H4N2等盐离子，获得纯化的鲤TLR2重组蛋白；步骤S4：鲤TLR2多克隆抗体的制备将步骤S3纯化的鲤TLR2重组蛋白作为抗原，蛋白质浓度用0.85wt%的生理盐水调整为500 μg/mL后对小鼠进行5次免疫，按体积比1:1的比例加入弗氏完全佐剂，采用腹部皮下多点注射，每隔1周加强免疫1次，共免疫5次，加强免疫选用弗氏不完全佐剂，末次免疫10天后进行全血分离，收集鼠抗血清，纯化得到鲤Toll样受体2多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的鲤Toll样受体2多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤S1中所述第一对特异性引物为：上游引物名称为TLR2
‑
ORF
‑
F；引物序列为5
´
‑
ATGCAATTCTTGGGAAGAG
‑3´
；下游引物名称为TLR2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯军厂，崔文姗，朱超杰，王先锋，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：