一种固液结合法制备依降钙素的方法技术

本发明专利技术提供一种固液结合法制备依降钙素的方法，其包括：应用Fomc/tBu方法，以Fmoc

【技术实现步骤摘要】
一种固液结合法制备依降钙素的方法


[0001]本专利技术涉及药物制备
，特别涉及一种固液结合法制备依降钙素的方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]依降钙素可用于治疗骨质疏松症引起的骨痛，能够抑制破骨细胞活性，减少骨的吸收，防止骨钙丢失具有改善骨强度、骨皮质厚度、骨钙质含量、骨密度等作用。依降钙素是鲑鱼降钙素的衍生物，二者的主要差别为鲑鱼降钙素是由N端Cys1的巯基与Cys6的巯基形成二硫键的长链环肽，而依降钙素由31个氨基酸残基组成、N端Ser1的氨基与Asu6侧链羧基形成酰胺环的长链环肽，相对而言依降钙素的结构更为复杂。
[0004]依降钙素的分子式为C
148
H
244
N
42
O
47
，分子量为3363.77，其结构为：
[0005][0006]目前依降钙素通过化学合成法进行制备，专利EP0452514B1采用Boc策略进行依降钙素的合成，将依降钙素的序列分为两个片段：Ser1～Gly9和Lys
10
～Pro
31
，片段Ser1～Gly9是通过全液相合成的方式进行制备，与固相合成方法相比液相合成操作后处理步骤繁琐，需要反复的浓缩、中和、洗涤、萃取、沉淀、重复沉淀等步骤，反应收率低、反应周期长，且许多反应步骤须在低温条件下进行。将片段Ser1～Gly9缩合至Lys
10
～Pro
31
‑
MBHA树脂，需要使用酸性、腐蚀性更强的HF裂解肽树脂。并且采用Boc合成策略时每个氨基酸偶联完毕脱Boc的过程中均需使用TFA脱除每个氨基酸N端的Boc保护基，然后使用碱对TFA中和，再用溶剂对其洗涤；而采用Fmoc合成策略只需要使用20％的哌啶/DMF脱除每个氨基酸N端的Boc保护基，只通过溶剂洗涤一种方式即可。此外，由于采用Boc合成策略，因此所需的氨基酸为Boc保护氨基酸，随着固相多肽合成技术的不断发展进步现如今Boc合成策略基本被淘汰，当下的固相多肽合成基本完全采用Fmoc合成策略，保护氨基酸的生产厂家基本以生产Fmoc保护氨基酸为主，很少生产Boc保护氨基酸，因此Boc保护氨基酸均不是常规的保护氨基酸，需要定制、延长货期。专利US 5739272公开了两种合成方式：一种是将依降钙素的序列分为两个片段，片段1(Ser1～Gly9)和片段2(Lys
10
～Pro
31
)，片段1(Ser1～Gly9)通过固相合成的方式获取，裂解后再缩合至Lys
10
～Pro
31
‑
树脂，由于固相合成方法的假稀释效应，在片段缩合时羧基组分是大大过量的(通常为2至5倍摩尔当量)，因此通过片段合成的方法需要更大的投料量，而Asu价格十分昂贵，增加Asu的消耗量，增加生产成本；另一种是采用逐个氨基酸单独偶联的方式在树脂上进行合成。

技术实现思路

[0007]为了改善现有技术的不足，本专利技术提供了一种固液结合法制备依降钙素的方法。本专利技术采用液相合成与固相合成结合的方式得到线性依降钙素肽树脂，进行固相环化得到依降钙素肽树脂，裂解得到的粗肽经纯化、冻干，得到依降钙素纯品多肽，提高了合成产物纯度和纯化收率，降低了生产成本，利于大规模生产，解决了现有技术的生产周期长、生产效率低、保护氨基酸消耗量大的问题。
[0008]具体地，本专利技术的技术方案如下所述：
[0009]本专利技术提供了一种固液结合法制备依降钙素的方法，其包括：应用Fomc/tBu方法，以Fmoc
‑
Pro
‑
CTC树脂为固相合成载体依Gln
13
‑
Pro
22
片段序列缩合制备依降钙素肽树脂I然后裂解得到依降钙素片段I，以Fmoc
‑
Pro
‑
氨基树脂为固相合成载体依Arg
23
‑
Pro
31
片段序列缩合制备依降钙素肽树脂II，将依降钙素片段I通过固相合成方式缩合至依降钙素肽树脂II上，并按照依降钙素氨基酸序列继续缩合得到依降钙素肽树脂，其中，Leu3、Ser4、Leu
11
、Ser
12
以假脯氨酸二肽片段的形式进行缩合以引入序列，继续缩合的肽片段和氨基酸为Fmoc
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]‑
OH、Fmoc
‑
Lys(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
Asu(OAll)
‑
OH、Fmoc
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]‑
OH和Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
OH。
[0010]其中，所述依降钙素肽树脂的结构为NH2‑
Ser(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]‑
Thr(tBu)
‑
Asu(OAll)
‑
Val
‑
Leu
‑
Gly
‑
Lys(Boc)
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]‑
Gln(Trt)
‑
Glu(OtBu)
‑
Leu
‑
His(Trt)
‑
Lys(Boc)
‑
Leu
‑
Gln(Trt)
‑
Thr(tBu)
‑
Tyr(tBu)
‑
Pro
‑
Arg(Pbf)
‑
Thr(tBu)
‑
Asp(OtBu)
‑
Val
‑
Gly
‑
Ala
‑
Gly
‑
Thr(tBu)
‑
Pro
‑
氨基树脂。
[0011]在本专利技术的实施方式中，针对缩合困难氨基酸Val7以Val7‑
Leu8‑
Gly9三肽片段进行缩合以引入序列、缩合困难氨基酸Thr5以Thr5‑
Asu6二肽片段进行缩合以引入序列降低氨基酸缩合难度。
[0012]在本专利技术的实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固液结合法制备依降钙素的方法，其包括：应用Fomc/tBu方法，以Fmoc
‑
Pro
‑
CTC树脂为固相合成载体依Gln
13
‑
Pro
22
片段序列缩合制备依降钙素肽树脂I然后裂解得到依降钙素片段I，以Fmoc
‑
Pro
‑
氨基树脂为固相合成载体依Arg
23
‑
Pro
31
片段序列缩合制备依降钙素肽树脂II，将依降钙素片段I通过固相合成方式缩合至依降钙素肽树脂II上，并按照依降钙素氨基酸序列继续缩合得到依降钙素肽树脂，其中，Leu3、Ser4、Leu
11
、Ser
12
以假脯氨酸二肽片段的形式进行缩合以引入序列，继续缩合的肽片段和氨基酸为Fmoc
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]
‑
OH、Fmoc
‑
Lys(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
Asu(OAll)
‑
OH、Fmoc
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]
‑
OH和Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
OH。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述依降钙素肽树脂的结构为NH2‑
Ser(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]
‑
Thr(tBu)
‑
Asu(OAll)
‑
Val
‑
Leu
‑
Gly
‑
Lys(Boc)
‑
Leu
‑
Ser[psi(Me,Me)Pro]
‑
Gln(Trt)
‑
Glu(OtBu)
‑
Leu
‑
His(Trt)
‑
Lys(Boc)
‑
Leu
‑
Gln(Trt)
‑
Thr(tBu)
‑
Tyr(tBu)
‑
Pro
‑
Arg(Pbf)
‑
Thr(tBu)
‑
Asp(OtBu)
‑
Val
‑
Gly
‑
Ala
‑
Gly
‑
Thr(tBu)
‑
Pro
‑
氨基树脂。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，肽片段Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
Asu(OAll)
‑
OH、和Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
OH采用液相合成法合成，其中，二肽片段Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
OH的合成方法包括：(a)将Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OSu；(b)将Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OSu和H
‑
Asn(Trt)
‑
OH在碱催化下生成Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
OH；二肽片段Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
Asu(OAll)
‑
OH的合成方法包括：(a)将Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
OSu；(b)将Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
OSu和H
‑
Asu(OAll)
‑
OH在碱催化下生成Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
Asu(OAll)
‑
OH；三肽片段Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
Gly
‑
OH的合成方法包括：(a)将Fmoc
‑
Val
‑
OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc
‑
Val
‑
OSu；(b)将Fmoc
‑
Val
‑
OSu和H
‑
Leu
‑
OH在碱催化下生成Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
OH；(c)Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
OSu；(d)将Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
OSu和H
‑
Gly
‑
OH在碱催化下生成Fmoc
‑
Val
‑
Leu
‑
Gly
‑
OH。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Fmoc
‑
Pro
‑
CTC树脂的制备方法包括：将Fmoc
‑
Pro
‑
OH缩合至CTC树脂，并进行封闭反应得到；优选地，CTC树脂的替代度为0.5
‑
1.5mmol/g；优选地，所述制备方法包括：将Fmoc
...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬胜利，殷金岗，刘超，
申请(专利权)人：润辉生物技术威海有限公司，
类型：发明
国别省市：