一种得到高纯度异源抗体的方法技术

本发明专利技术属于抗体工程领域，提供了一种得到高纯度异源抗体的方法，所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链，在其中一条重链恒定区的I253引入突变，进而通过蛋白A亲和层析纯化，即可获得高纯度的双特异性抗体，其中，以上所述的氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。本发明专利技术仅在重链引入一个突变，将重链恒定区中的EU编号第253位的Ile突变为Asn，即可只通过一步蛋白A亲和层就能将异源抗体的纯度提高到99％以上，大大简化了纯化步骤，降低制备成本，具有广阔的商业应用前景。具有广阔的商业应用前景。具有广阔的商业应用前景。

A method of obtaining high purity heterologous antibody

【技术实现步骤摘要】
一种得到高纯度异源抗体的方法


[0001]本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一种得到高纯度异源抗体的方法，所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链。

技术介绍

[0002]双特异性抗体有多种构建方式，其中IgG型双特异性抗体具有和普通抗体相似的结构、理化性质和Fc段功能。通常IgG型双特异性抗体由两条氨基酸序列不同的重链(即抗抗原A的重链和抗抗原B的重链)和两条氨基酸序列不同的轻链(即抗抗原A的轻链和抗抗原B的轻链)组成。当4条多肽链组合时，会产生8种不同的组合方式，其中只有一种为所需要的目标抗体分子。而从8种分子中分离纯化得到目标分子效率极低且非常困难。
[0003]作为解决该问题的方法，文献1报道了使用共同重链和两条不同轻链组合的方法。但该方法的局限性在于，要筛选得到氨基酸序列完全相同的抗抗原A的重链和抗抗原B的重链非常困难。文献2、3报道了使用共同轻链和两条不同重链组合的方法。但该方法的局限性在于，2条不同的重链会有3种组合方式，包括一种异源抗体(双特异性抗体)和两种同源抗体(杂质)，其中目标双特异性抗体的比例理论上通常只有约50％。如果提高2条重链异源缔合的效率，则可将目标双特异性抗体的表达效率提高到90-95％(文献4)。为了进一步去除两种同源抗体，文献5报道了下述方法：通过在两种重链的可变区引入氨基酸突变赋予两种同源抗体和目标双特异性抗体不同的等电点，从而通过离子交换层析纯化得到目标双特异性抗体。然而需要注意的是，在IgG型抗体商业化制备过程中，离子交换层析并非必需的纯化步骤，增加离子交换层析固然可以提高目标抗体的纯度，但也降低了最终的产率，导致制备成本增加。
[0004]蛋白A亲和层析作为IgG型抗体必需的纯化步骤，如何通过蛋白A亲和层析得到高纯度的双特异性抗体成为研究的新方向。文献6报道了一种方法：使用由小鼠IgG2a的重链(可与蛋白A结合)和大鼠IgG2b的重链(不与蛋白A结合)组成双特异性抗体，仅利用蛋白A纯化即可将目标双特异性抗体纯化至95％的纯度。但该方法的局限性在于，小鼠和大鼠的重链恒定区免疫原性极高(文献7)，而且利用该方法制备的抗体卡妥索单抗(Catumaxomab)在人体内半衰期为约2.1天，与通常的人IgG半衰期2-3周相比极短(文献8)。文献9报道了另一种利用蛋白A纯化得到高纯度的双特异性抗体的方法：在构成双特异性抗体的其中一条重链恒定区上引入突变。具体来说，将EU编号第435位的His突变为Arg，从而改变与蛋白A的结合力，能将目标抗体纯化至93-99.6％不等的纯度。
[0005]文献1：Fischer,N.,et al.(2015).Nat Commun 6:6113.
[0006]文献2：WO98050431
[0007]文献3：WO2006109592
[0008]文献4：WO2006106905
[0009]文献5：WO2007114325
[0010]文献6：WO95033844
[0011]文献7：Clin Cancer Res 2007 13:3899-3905
[0012]文献8：J Clin Oncol 26:2008(May 20suppl；abstr 14006)
[0013]文献9：WO2011078332

技术实现思路

[0014]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种仅利用蛋白A亲和层析即可得到高纯度异源抗体的方法。本专利技术通过在重链恒定区引入新的突变，改变与蛋白A的结合力，进而通过蛋白A亲和层析，即可获得纯度>99％的双特异性抗体。
[0015]本专利技术的第一个方面是提供一种得到高纯度异源抗体的方法，所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链，在其中一条重链恒定区的I253引入突变，进而通过蛋白A亲和层析纯化，即可获得高纯度的双特异性抗体，其中，以上所述的氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
[0016]本专利技术中的氨基酸的位置均根据KABAT编号的EU索引确定。
[0017]优选地，所述突变为I253N，即Ile253被替换为天冬酰胺(N)。
[0018]其中，所述异源抗体包括但不限于为双特异性抗体、一价抗体、Fc融合蛋白等。即本专利技术中所述异源抗体可以为双特异性抗体、一价抗体、或Fc融合蛋白等。
[0019]本专利技术的第二个方面是提供一种异源抗体所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链，其中一条重链恒定区的I253发生突变。
[0020]优选地，所述突变为I253N，即Ile253被替换为天冬酰胺(N)。
[0021]其中，所述异源抗体包括但不限于为双特异性抗体、一价抗体、Fc融合蛋白等。即本专利技术中所述异源抗体可以为双特异性抗体、一价抗体、或Fc融合蛋白等。
[0022]本专利技术的第三个方面是提供一种编码本申请第二个方面所述异源抗体中I253发生突变的重链的核苷酸序列。
[0023]本专利技术的第四个方面是提供含有本专利技术第三个方面所述的核苷酸序列的重组载体。
[0024]其中，上述各重组载体所使用的表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本专利技术对此不作特别限定。
[0025]本专利技术的第五个方面是提供含有本专利技术第四个方面所述重组载体的重组宿主细胞。
[0026]本专利技术所述的重组宿主细胞的原始宿主细胞可以为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。其中所述原始宿主细胞可以原核表达细胞或真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表
达全长IgG抗体)。将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本专利技术优选的重组宿主细胞。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
[0027]作为优选的方案，所述重组宿主细胞的原始宿主细胞优选为真核细胞，进一步优选为CHO细胞或293E细胞。
[0028]本专利技术的第六个方面是提供一种组合物，其含有：(1)本专利技术第二个方面所述的异源抗体，以及(2)药学上可接受的载体和/或稀释剂和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种得到高纯度异源抗体的方法，其特征在于，所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链，在其中一条重链恒定区的I253引入突变，进而通过蛋白A亲和层析纯化，即可获得高纯度的双特异性抗体，其中，以上所述的氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变为I253N。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异源抗体为双特异性抗体、一价抗体或Fc融合蛋白。4.一种异源抗体，其特征在于，所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链，其中一条重链恒定区的I25...

【专利技术属性】
技术研发人员：周易，
申请(专利权)人：周易，
类型：发明
国别省市：